J. Am. Chem. Soc.|荧光工具箱直接可视化活细胞中的多步骤蛋白质聚集过程

大家好，今天给大家分享一篇最近发表在JACS上的文章，通讯作者是美国宾夕法尼亚州立大学哈克生命科学研究所的张鑫教授。

蛋白质聚集是一个多步骤的过程，人类的许多疾病和它息息相关，包括神经退行性疾病、代谢疾病和一些癌症。在生物中由于错误折叠产生的单体，通过相互结合形成错误折叠的齐聚物(图1a)。这些错误折叠的齐聚物进一步演变成淀粉样原纤维、无定形聚集物或应力颗粒形式的不溶性聚集物(图1a)。最近几十年的研究已经阐明了蛋白质的结构、相互作用和活性，包括其天然折叠结构或淀粉样原纤维等不溶性聚集物。然而，在蛋白质折叠中，这两种极端状态之间存在着多种中间物种在这里，我们将这些构象统称为错误折叠的低聚物，包括可溶性低聚物和由错误折叠的蛋白质驱动形成的淀粉体前低聚物。越来越多的证据表明，错误折叠的低聚物可能在细胞生理和病理中发挥关键作用。

图1 a) 含氟探针可视化蛋白质聚集的示意图 b) S0态和激发态S1态的HBI构造C）探针的雅布伦斯基图

由于需要可靠地检测活细胞中蛋白质的聚集，因此出现了一组基于荧光的方法。最先出现的化学染料(如蛋白酶测定试剂盒)可以检测细胞内不溶性聚集物。但是，这种方法需要细胞固定和膜透性，不适合活细胞。接下来人们使用荧光蛋白融合(FP)或标记荧光探针到感兴趣蛋白(POI)的荧光显微镜和使用代谢标记的拉曼散射显微镜，通过观察活细胞中的荧光颗粒来可视化POI的聚集。其次人们通过量化FP-熔融POI的扩散常数，以区分不溶性聚集体和折叠蛋白。这样的分析或许不能轻易地区分错误折叠的低聚物和折叠的蛋白质，因为两者都表现出相似的扩散常数。然而，这种方法缺乏活细胞成像能力。最后,人们通过FP融合POI的荧光共振能量转移(FRET)来区分错误折叠的低聚物和折叠的蛋白。尽管在过去的几十年里进行了大量的研究，但是还没有一种简单直接的方法能够使活细胞成像检测蛋白质聚集的中间种类，区分错误折叠的低聚物和不溶性聚集物，并监测这两种构象之间的转变。

在此，作者报道了一系列新的荧光探针，命名为AggFluor，这是第一次在活细胞中直接可视化的多步骤蛋白质聚集过程。当AggFluors共价结合到基因融合到折叠POI的蛋白标签上时，其荧光被熄灭。然而，错误折叠的齐聚物或POI的不溶性聚集物的形成抑制了猝灭并产生开启荧光。AggFluor是基于合成的绿色荧光蛋白(GFP)发色团4-羟基苄烯基咪唑啉酮(图1b)，属于分子转子型荧光团，在生物成像中得到了广泛应用。激发态HBI经历旋转,因此表现出黑暗荧光由于非辐射的衰减휑通过扭曲的分子内电荷转移(TICT)。化学和生物的限制以及环境粘度的限制可以通过抑制HBI在激发态的旋转来恢复其荧光发射。在之前的工作中，zuoz1报道了第一个HBI衍生物AggFluor P1，它具有二甲基氨基苄基的二乙烯基延伸(图2a)。尽管P1在错误折叠的齐聚物和不溶性聚集物中都显示了开启荧光，但它不能区分含有错误折叠的齐聚物或不溶性聚集物的颗粒，因为错误折叠的齐聚物可以存在于颗粒结构中。

图2 a) P1的结构 b) 强度与粘度的双对数曲线线性拟合测量粘度敏感性C）P1的荧光强度增加了1.5倍 d）P1在激发时的供体和受体 e）激发态旋转势垒 f）TICT开始时转角大于45       

为了进一步区分错误折叠的低聚物和不溶性聚集体，作者探索了在不同粘度下控制HBI荧光激活的化学原理。作者发现旋转抑制与环境粘度之间的相关性主要是由于发光态和TICT态之间的激发态旋转障碍(图1c)。此外，作者发现旋转势垒由与HBI形成电子共轭的独立部分控制，此处称为电子密度调节器(EDR)。此外，作者利用这一技术演示了小分子蛋白稳定调节剂是如何在两种构象状态下驱动蛋白质聚集物的形成和分解的，这为未来针对以蛋白质聚集为基础的广泛的蛋白质错折叠疾病的治疗探索提供了重要基础。

之前的研究表明，错误折叠的低聚物具有多孔性和松散的填充环境，而不溶性聚集体具有更坚固和紧密的填充结构。作者假设P1应该具有化学性质，可以在低粘度的微环境中激活荧光。为了验证这一假设，作者使用一系列乙二醇和甘油混合物，量化了P1在不同粘度下激活荧光的方式(图2b)。作者发现P1的荧光量子产率随着甘油的增加而上升(图2)，这表明即使在低粘度的溶剂下P1也能发出荧光。

作者又进一步研究了如何设计具有理想粘度灵敏度的AggFluor探针。对于P1，作者发现它的二乙烯基LUMO分子轨道与受体重叠，形成延伸到供体的共轭。因为共轭轨道抵抗旋转，作者假设二乙烯基的电子密度会导致更高的旋转势垒P1。在此，作者将二乙烯基命名为电子密度调节器(EDR)，其电子密度应与旋转的活化能(Ea)呈正相关，并控制粘度灵敏度。作者选择了P1和P18来证明AggFluor探针对多步骤蛋白聚集过程的实践能力，期望P1在错折的齐聚物中激活荧光，而P18只有在不溶性聚集物中才会发光(图3)。为此，作者采用了最近开发的AggTag方法(图3b)，其中P1或P18可以与卤代烃融合蛋白(POI-Halo)共价结合。使用优化的卤代连接剂和反应，P1和P18可以延伸到POI周围的微环境中，从而在蛋白错折或聚集时发射亮起荧光(图3b)。其中P1h和P18h的分子结构如图所示(图3c)，将他们与纯化的SOD1- a4v晕蛋白偶联，两者均表现出低荧光背景，量子产率可以忽略。在59℃加热可以诱导SOD1-A4V的聚集，用浊度可以测量不溶性聚集物的形成。(黑色曲线，图3d). TEM进一步揭示了SOD1-A4V的不溶性聚集体呈现出非晶态、紧密排列的结构，这解释了为什么P18h的旋转可以被阻止以激活其荧光.

图3 a) P1检测错折叠的低聚物和不溶性聚集体 b) AggTag方法的图表C）P1h和P18h的结构 d）探针下聚集的荧光和浊度动力学 e）聚集体的TEM图像显示了大的致密结构

在活细胞中区分不溶性聚集体和错误折叠的低聚物是可取的，因为它们具有不同的功能，细胞对它们的管理也不同. 虽然目前还没有实现这一目标的技术，但作者设想P1h和P18h的组合可以实现双色成像平台，其中P1h和P18h的荧光可以监测错误折叠的低聚物和不溶性聚合物. 对于P1h和P18h，低荧光背景会导致蛋白错误折叠(图4b)。使用P1h、P18h和带有荧光的香豆素配体在表达SOD1-A4V-Halo、HttQ19-Halo和HaloTag的细胞中进行的三探针标记实验证明，荧光最小并不是由于缺乏蛋白表达. 作者用蛋白酶体抑制剂MG132处理表达SOD1–A4V的细胞。在应力诱导8h时，作者观察到P1h荧光在扩散和小颗粒结构中的激活(图4c). 当这种应力状态持续24小时后，观察到核附近的大颗粒，从P1h和P18h中都显示出绿色荧光(图4c)，与聚集体相对应，聚集体包裹着不溶的聚体. 因此,P1h和P18h的共同作用下第一次监测到两步聚合过程SOD1-A4V与MG132细胞治疗,特别是同时使用两种不同的颜色来可视化中间错误折叠寡聚物颗粒或扩散形式和最终产品中不溶性聚合物(图6d). 用MG132处理细胞24小时，明显诱导了错误折叠的Htt-Q46-Halo齐聚物形成聚集体，聚集体同时显示出P1h和P18h的荧光信号(图4e)。当在HEK293T细胞中表达时，Htt-Q110-Halo只形成核周聚集体，这是一种不溶性聚集体，P1h和P18h都显示出明亮的荧光(图4f)。因此作者开发了一类新的荧光探针，AggFluor。利用结构与功能关系和量子化学的研究揭示了通过在绿色荧光蛋白的HBI发色团核中加入电子密度调节剂(EDR)来控制黏度敏感性的策略。

图4 a）P1h和P18h的归一化激发和发射光谱。 b) P1h和P18h深色背景，缺乏蛋白质聚集 b) MG132诱导的SOD1 -A4V在8和24小时聚集 c) 在表达POI晕的细胞中，胁迫条件诱导POI聚集，形成错误折叠的齐聚物,随后形成不可溶聚集物 d）光晕聚合体的化学调制 e）P1h和P18h检测到的核周颗粒聚集体

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c07245

DOI：10.1021/jacs.0c07245