分享一篇发表在Angew上的文章，文章的题目是“Diethynyl Phosphinates for Cysteine-Selective Protein Labeling and Disulfide Rebridging”，通讯作者是来自柏林洪堡大学和莱布尼茨分子药理学研究所的Christian P. R. Hackenberger教授，他的实验室结合有机化学、生物化学和生物物理学，侧重于开发蛋白质修饰的化学合成方法。在这篇文章中作者基于二乙炔基磷酸盐开发了一种功能化的蛋白-蛋白耦合物合成方法。

      对生物分子进行位点选择性的化学修饰在生命科学和药物开发中非常重要，其中半胱氨酸Cys作为修饰位点具有亲和性强、总体丰度低（因此容易实现单位点功能化）等优点，目前Cys标记中应用最广泛的是Michael加成受体马来酰亚胺。但该结构在存在其他硫醇分子或者还原环境中较不稳定。除了单位点的Cys化学修饰，双反应位点的Cys试剂也应用广泛，其主要应用于抗体的功能化，用于提升抗体的热稳定性。在之前的研究中作者团队开发了不饱和磷酰胺和硫代磷酸酯作为亲电试剂，用来标记Cys，产生高度稳定的共轭结构。因此在本工作中，作者希望能基于这种稳定Cys标记方法，开发一种双位点的Cys标记试剂，并将其用于二硫键的重构。

      作者首先假定同一磷原子上的2个乙炔基可以分别与2个巯基反应，这类分子曾被用于生成杂环，但还没有标记Cys的报道。作者以二氯亚磷酸乙酯和乙炔溴化镁为原料出发，并比较了P-N键和P-O键的结构，最终合成了一系列P-O键作为linker的衍生物。接着作者首先在多肽水平对它们的双功能标记进行的检测，通过使用FRET标记的多肽和小分子，作者观察到在血清或者外加过量游离巯基的情况，这些分子都能形成双Cys标记复合物，并能稳定存在，只有在强碱下复合物才能发生β消除。

      在验证了小分子和多肽上的反应性后，作者使用具有单个Cys的eGFP突变体S147C，以PBS和10% DMSO为溶剂，加入10 当量的磷酸酯半个小时即完成标记，且圆二色光谱和荧光光谱显示eGFP的二级结构没有发生改变，串联质谱也证明没有副反应发生。作者进一步测试了泛素G76C、组蛋白H4和重组人白蛋白，都获得一致的结果，证明了该类磷酸酯对Cys优良的选择性。此外作者还进行了一些动力学的测试，结果显示第二个Cys的标记较慢，这可能是扩散成为了反应限速步。

      接下来作者开始探索利用双功能磷酸酯进行蛋白-蛋白复合物的构建。作者首先通过双功能磷酸酯构建了一个十精氨酸(R10)-eGFP的复合物，并通过荧光显微镜证明该结构在细胞中的稳定性。

      最后作者使用曲妥珠单抗进行了实验。作者首先使用TCEP将抗体还原，随后将入5 当量的双炔基磷酸酯室温反应过夜，SDS-PAGE显示95%的抗体实现了rebuild。作者进一步使用带炔基酯衍生的磷酸酯处理抗体，并通过CuAAC反应click上荧光团，实现了对抗体的功能化。

      综上所述，作者基于之前的工作开发了一种基于二乙炔磷酸酯的蛋白质Cys选择性标记试剂和二硫键rebuild的新方法，并在单抗上实现了对抗体的rebuild和功能化。

本文作者：LYP

责任编辑：Guo ZH

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202100683

原文引用：DOI：10.1002/anie.202100683