分享一篇发表在Angew.chem.上的文章: “Diethynyl Phosphinates for Cysteine-Selective Protein Labeling and Disulfide Rebridging”，通讯作者是来自柏林洪堡大学和莱布尼茨分子药理学研究所的Christian P. R. Hackenberger教授。课题组主要致力于发展新的偶联方法用于纯蛋白质或是活细胞中蛋白质的功能化修饰。

用小的化学手柄对生物分子进行位点选择性修饰在生命科学和药理学中有大量的应用。其中半胱氨酸Cys具有亲和性强、总体丰度低等优点常被作为修饰位点。其中，马来酰亚胺的硫代-迈克尔加成反应是应用最广泛的方法，但该结构在存在其他硫醇分子或者还原环境中不稳定。

除了单个Cys修饰外，双反应性Cys特异性试剂也广泛应用于修饰多肽或蛋白质。主要用于抗体功能化，可以提高抗体的热稳定性。

在此之前，作者课题组开发了不饱和磷酰胺和硫代磷酸酯作为亲电试剂，用来标记Cys，产生高度稳定的共轭结构。在此基础上，作者希望能基于这种稳定Cys标记方法，开发一种双位点的Cys标记试剂，并将其用于二硫键的重构。

作者以二氯亚磷酸乙酯和乙炔溴化镁为原料，并比较了P-N键和P-O键的结构，最终合成了一系列P-O键作为linker的衍生物。接着作者首先在多肽水平对它们的双功能标记进行检测，作者观察到在血清或者外加过量游离巯基的情况，这些分子都能形成双Cys标记复合物，并具有较好的稳定性。

接着作者开始测试它们对蛋白质修饰的适用性。作者使用具有单个Cys的eGFP突变体S147C，以含10% DMSO的PBS为溶剂，加入10 当量的磷酸酯30min即完成标记，通过圆二色谱(CD)和荧光光谱分析表明，eGFP的二级结构在修饰后没有改变，串联质谱也证明没有其他氨基酸被修饰。作者进一步测试了泛素G76C、组蛋白H4和重组人白蛋白，都获得一致的结果，证明了该类磷酸酯对Cys优良的选择性。此外作者还进行了反应动力学的测试，结果显示第二个Cys的标记较慢，可能是因为扩散成为限制因素。

接下来作者开始探索利用双功能磷酸酯进行蛋白-蛋白复合物的构建。作者通过双功能磷酸酯构建了一个eGFP-1-R₁₀的复合物，并通过细胞成像证明该结构在活细胞中的稳定性。

最后，作者利用Her2靶向的单克隆抗体曲妥珠单抗，研究了二乙炔基膦酸酯对抗体的桥联能力。首先用TCEP还原抗体，随后，在溶液中加入5当量的亚磷酸酯，在室温下过夜反应。凝胶电泳和质谱分析表明，>95%的抗体实现了rebridging。作者还使用带炔基酯衍生的磷酸酯修饰抗体，并通过CuAAC反应接上荧光团，实现了对抗体的功能化。并通过细胞实验验证重新桥联和标记策略不会阻碍抗体的性能。

综上所述，作者开发了一种基于二乙炔磷酸酯的蛋白质Cys选择性标记试剂和二硫键桥连的新方法，并在单抗上实现了对抗体的桥连和进一步的功能化。这种简单明了的半胱氨酸选择性蛋白和抗体修饰策略将有助于开发生物和生物制药应用的新工具。

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DOI：10.1002/anie.202100683