通讯作者：贾铁争，南方科技大学；刘永宏，中国科学院南海海洋研究所

作者：Hong Liu, Guolin Li, Zhiyuan Peng, Shishuo Zhang, Xin Zhou, Qingchao Liu, Junfeng Wang, Yonghong Liu*, and Tiezheng Jia*

半胱氨酸在多种生命过程中起着关键作用，如调节细胞内的氧化还原水平以及与辅酶金属中心的配位等。由于半胱氨酸中独特的巯基具有较强的亲核性，其在蛋白质的生物偶联中得到了广泛的应用。然而，基于巯基的偶联策略通常依赖于Michael加成或SN2反应，所产生的硫醚可以与游离半胱氨酸或谷胱甘肽进行硫醇交换，干扰了修饰片段的化学稳定性，也影响了后续化学生物学应用。 

近日，南方科技大学化学系贾铁争课题组基于此前炔烃与硫代磺酸酯的光氧化还原原子转移自由基加成（ATRA）反应的工作（Org. Lett. 2021, 23, 1054-1059.），与中科院南海所刘永宏研究员团队合作，发展了一例光氧化还原三组分芳基炔烃与二硫化物和亚磺酸盐的ATRA反应，避免了采用S-烷基硫代磺酸酯这一类化学稳定较差且合成上颇具挑战的化合物作为底物，制备了一系列的反式烷基磺酰基乙烯基烷基硫化物，具有较好的区域选择性以及顺反选择性。鉴于该反应温和的反应条件和广泛的官能团兼容性，这一策略被成功地应用于在液相中和树脂上标记多肽的半胱氨酸残基。特别值得一提的是，本研究成功将荧光探针ESAC标记在细胞穿膜肽TAT上，并观察到ESAC探针在进入细胞前后发射荧光由蓝色变为绿色，其变色机制是ESAC探针中二芳基酮和醇可以在细胞内氧化还原过程中相互转化（图1）。

图1. 光氧化还原三组分芳基炔烃与二硫化物和亚磺酸盐的ATRA反应及其在多肽标记中的应用

作者首先以苯乙炔、二甲基二硫和甲基亚磺酸钠为模板底物，经过一系列的条件优化确定了最优的反应条件，并且对反应的底物普适性进行了考察。该方法对于芳基炔烃、二硫化物以及亚磺酸盐类底物均表现出良好的官能团兼容性。在此基础上，作者将氧化还原响应变色荧光探针ESAC在固相上直接修饰于细胞穿膜肽TAT的半胱氨酸残基上，这一温和高效的方法融合固相合成方法后处理纯化便捷的优势，以1.3%的总收率成功得到探针标记TAT多肽产物7（图2）。

图2. 兼容固相合成的多肽分子修饰方法

进一步的活细胞共聚焦成像显示ESAC-TAT在三种不同癌症细胞系中均主要定位于细胞质，部分积聚在溶酶体中（图3）。值得注意的是，荧光探针ESAC在培养基中显示蓝色荧光，但在进入细胞后显示绿色荧光。

图3. ESAC荧光探针修饰的穿膜肽TAT在细胞内成像研究

光物理研究分析表明细胞内荧光探针中酮羰基和醇羟基之间的氧化还原相互转化可能是活细胞中ESAC发射荧光颜色变化的原因（图4）。

图4. 荧光探针的光物理研究

更为重要的是，ESAC荧光探针的颜色变化可以响应细胞内氧化活性物质的水平，从而发生逆转。当HeLa细胞经0.4uM双氧水处理后，细胞内ESAC的发射荧光可以由绿色恢复为蓝色，进一步佐证了酮羰基和醇羟基之间的转化是ESAC发射荧光变色的机制（图5）。

图5.（a）HeLa细胞经过氧化氢处理后胞内ESAC-TAT的成像；（b）HeLa细胞内蓝色与绿色荧光比例的定量分析；（c）HeLa细胞经0.4 uM H2O2处理后细胞活性分析。

该项工作提供了一种氧化还原响应变色荧光探针标记复杂多肽的简便方法。这一成果以“Tagging Peptides with a Redox Responsive Fluorescent Probe Enabled by Photoredox Difunctionalization of Phenylacetylenes with Sulfinates and Disulfides”为题发表在 JACS Au（JACS Au 2022, doi: 10.1021/jacsau.2c00577）上。文章的共同第一作者为南方科技大学硕士生刘红和南科大-西北大学交换硕士生李国林，通讯作者为南方科技大学化学系贾铁争助理教授和中国科学院南海海洋研究所刘永宏研究员。同时南科大科研助理彭志媛、博士后张世硕、南科大-西北大学交换硕士生周鑫、西北大学刘庆超教授以及南海所王俊锋副研究员都对该工作做出了重要贡献。此项研究得到了粤深联合基金、广东省自然科学基金、广东省催化重点实验室、国家自然科学基金以及南开大学元素有机重点实验室开放基金的大力支持。

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JACS Au 2022, ASAP

Publication Date: November 20, 2022

https://doi.org/10.1021/jacsau.2c00577

Copyright © 2022 The Authors. Published by American Chemical Society