分享一篇最近发表在Nature Communications上的文章，题目是“Cysteine-specific protein multi-functionalization and disulfide bridging using 3-bromo-5-methylene pyrrolones”, 文章的通讯作者是南开大学化学学院的周传政教授。周传政教授的研究方向包括化学生物学、药物化学和物理有机化学。

       半胱氨酸（Cys）由于有很高的亲核性，因此常用作蛋白化学修饰的理想位点。多种亲电试剂譬如马来酰胺、碘乙酰胺、烷基卤化物和二硫吡啶都可以对Cys进行特异性的标记，但是这些方法通常只能在一个Cys引入单个修饰。此外，除了游离的Cys，Cys-Cys之间二硫键也可用来进行化学修饰的，尽管有一些试剂如溴代马来酰胺、双砜和烷基砜等开发出来进行与二硫键进行桥联反应，但是其简易性和效率还有待提升。作者在之前报道5-亚甲基吡咯酮（5MPs）可以在Cys进行特异性的可逆共价修饰，且这类试剂制备简单，性质稳定。在本文中，作者在5MPs基础上发现3-溴-5-亚甲基吡咯酮（3Br-5MPs）除了对Cys特异性更高外，还可以实现Cys上的多重修饰以及二硫键桥联反应。

  首先作者比较了两种一步法合成3Br-5MPs的路线，发现由N-bromosuccinimide (NBS)氧化4-bromo-furfuryl acetate得到的中间体在与一级氨反应得到3Br-5MPs这种路线更温和，产率更高。随后作者比较3Br-5MPs衍生物的稳定性和反应活性，发现3Br-5MPs比马来酰胺的稳定更好，可以pH=6.0–9.5稳定至少5d。在研究与EtSH小分子的反应机理时发现，3Br-5MPs可以连续与两个巯基分子反应，并且验证了两种产物的稳定性，且在与第一个巯基反应后的产物，通过NaBH4还原后，不再与第二个巯基反应。因此3Br-5MPs可以实现在Cys的单个或者多重化学修饰以及二硫键桥联反应。作者在肽段和蛋白上来验证3Br-5MPs的反应活性后，随后H3-V35C蛋白上利用3Br-5MPs进行Cys上的多重化学修饰。作者现将带有荧光基团的3Br-5MPs与蛋白反应后，再加入Biotin-SH连接在3位上，即可以在蛋白Cys上实现荧光和生物素的双重标记。作者将生长激素抑制素中的二硫键用TECP还原后再与3Br-5MPs反应，可以实现二硫键桥联反应。

    作者最后利用在羊抗人IgG的Fab片段中二硫键与3Br-5MPs实现桥联反应，将抗体标记上荧光小分子，但不影响IgG抗体的生物活性，进而可以通过荧光成像来识别细胞表面抗原。

       总之， 作者发展了一种与半胱氨酸特异性反应的化学探针3Br-5MPs，该试剂制备简单且稳定性高的探针，可以实现蛋白中半胱氨酸上的多重修饰以及二硫键桥联反应。

本文作者：TH

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14757-4

文章引用：DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-14757-4