Angew. Chem. Int. Ed. |结晶诱导发光探针检测活细胞中无定形蛋白质聚集的合理设计

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今天推荐一篇Angew. Chem. Int. Ed.的文章,通讯作者是中国科学院大连化学物理研究所刘宇教授。

蛋白质的三维结构可获得生物的生理功能。基因突变,外来的蛋白质组应激,化学修饰衰老因素可能导致蛋白质错误折叠和聚集。蛋白质异常聚集将导致许多蛋白质构象疾病,包括神经肌肉变性、代谢紊乱,和心血管疾病。蛋白质聚集是一个复杂的多步骤液-固相分离过程,由不同的蛋白质构象状态组成,包括折叠、未折叠、错误折叠的可溶性低聚物和不溶性聚集体。这些高度动态的状态中,聚集蛋白根据其形态和生化特性可进一步分为淀粉样蛋白和无定形聚集蛋白。能够精确定位和区分这些构象对诊断和治疗有很高的作用。

当前,大多数蛋白质聚集传感器都集中在淀粉样蛋白上。这主要是因为淀粉样蛋白具有明确的β-折叠堆叠结构。 这种指导使作者能够合理设计化学探针,以选择性检测和干预淀粉样蛋白聚集。目前已经开发了一系列化学探针来可视化淀粉样蛋白-β缠结和阿尔茨海默病相关的疾病,研究重点是利用荧光探针和DNA核酸配体区分不同淀粉样蛋白的细微结构差异

Zhu等人设计了血脑屏障通透性AIEgen来绘制体内淀粉样-β斑块然而,细胞内无定形蛋白聚集具有随机和不确定的结构,通常被认为是不可靶向或不可用药的小分子探针,尽管它们在细胞生理和病理中起着重要作用。非晶态蛋白聚集体缺乏明确的结构,使得它们无法通过化学传感器设计策略被定位。选择性检测无定形聚集物的另一个挑战是如何在复杂的细胞环境中实现对其他细胞器的选择性,因为它们在细胞内聚集,而不是在细胞外空间聚集淀粉样聚集物。尽管AIEgens在检测淀粉样聚集蛋白方面表现出了吸引人的性能,但他们未能检测到与蛋白质无共价连接的细胞无定形蛋白。因此,作者设计的具有可控性质的非晶态聚集蛋白传感器可能会对该领域进行补充。

在这项工作中,作者设计了一系列基于双氰异佛尔酮(DCI) AIEgen支架的无定形蛋白聚集传感器(图1b)。通过对结构-荧光关系的系统研究,作者可以调控荧光敏感性、结合亲和性、荧光颜色和细胞性能的结构部分。通过光物理测量、生物物理分析和理论计算的结合,作者确定了AIEgen获得满意性能的三个关键要素:(1)极性和粘度敏感性上调的二甲氨基苯是识别无定形聚集物和开启荧光的关键基团;(2)吸电子基团对发射波长进行微调;(3)平衡探针的亲脂性和溶解度有助于细胞成像的信噪比。作者进一步证明了这些特性一般适用于其他AIEgens。

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1。聚集诱导发光探针(AIEgen)检测活细胞中的无定形蛋白聚集。

蛋白质的错误折叠和聚集伴随着内部极性变化和粘度变化。为了感知这些微环境的变化,AIEgens检测无定形蛋白质聚集的第一个挑战是获得对极性和粘度的荧光敏感性。作者利用双氰基异佛尔酮(DCI)AIEgen支架作为模型(图2a)。首先,DCI支架包含D-π-A结构,该结构控制辐射时的分子内电荷转移(ICT)和随之产生的极性敏感性。其次,DCI支架的旋转键导致在激发态下扭曲的分子内电荷转移(TICT),从而控制其粘度敏感性。

为此,作者在DCI支架的基础上合成了两组不同对称性和给电子密度的探针(图2b,2 c)。A系列含有不对称的芳香基团,而B系列含有对称的苯基衍生物。这些取代基的对称性被提出来决定其激发态的键旋转,从而可以控制其对粘度的敏感性。在每个系列中,作者进一步调节了供电子基团中的电子密度,得到了相对电子(A5-A8, B4-B9)和缺电子(A1-A4, B1-B3)探针(图2b, 2c)。由于电子分布会影响分子内电荷转移(ICT),因此电子密度的调节可能有助于荧光对极性的敏感性。


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2。通过改变电子给电子基的对称性和电子密度来调节双氰异佛尔酮(DCI)探针的极性和粘性

通过黏度依赖关系(χ值)和相对荧光强度对不同取代类型的黏度敏感性进行相关性研究。χ值描述了荧光强度随粘度增加而增强的梯度。作者发现,不对称EDG的A系列探针的平均χ值略高于对称EDG的B系列探针(图3a;3 c)。解释了不对称芳香取代是如何通过调节TICT过程来控制粘度依赖性的。除了黏度依赖外,在黏性溶剂中,过量电子EDGs探针的平均荧光强度要高于缺乏电子的探针(图3d;3e),而取代基的对称性对荧光强度的控制作用较小(图3d;3 f)。因此,取代EDGs的对称性调节了黏度依赖性(χ值),电子密度控制了最大荧光强度

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3。EDGs的对称性和电子密度调节粘度灵敏度。

通过测量不同极性溶剂中的溶剂致色性(发射波长位移)和相对荧光强度,进一步研究了这些结构调制对极性灵敏度的影响。作者首先量化了荧光发射波长从极性甲醇到非极性二恶烷的转移。与粘度情况不同,在荧光波长位移方面,电子过量的EDGs探针比电子不足的EDGs探针对溶剂极性更敏感(图4a;4 b)。同时,这些电子过量基团提高了非极性二恶烷的最大荧光强度,模拟了聚集蛋白的疏水内部(图4d;4 e)。有趣的是,EDG中这些取代基的对称性既不调节极性相关的波长偏移(图4c),也不调节强度增强(图4f)。总之,探针的荧光极性灵敏度受其激发态结构的偶极矩的影响是一致的。这种偶极矩主要取决于探针的电子密度分布,而不是它的对称性

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4。EDGs的电子密度调节极性灵敏度。

在这项工作中,作者的目的是有选择地识别无定形聚集物。作者选择大肠杆菌二氢叶酸还原酶(E. coli dihydrofolate reductase, DHFR)作为模型蛋白,因为它聚集成无定形形态。作者检测了所研究的探针对热诱导DHFR聚集的荧光响应。总的来说,含有过量电子对称苯基取代的B5到B9探针比其他探针显示出更高的荧光强度和聚集蛋白的较大变化倍数(图5a)。重要的是,A系列(A5-A8)中含有不对称电子过量基团的探针对非晶态蛋白聚集没有反应,尽管它们在粘性和非极性溶剂中都具有很高的荧光。这些观察结果表明,识别无定形聚集蛋白(B5-B9)的探针必须对粘度和极性敏感。这些结果也暗示DCI支架中对称的对氨基苯基可能有助于对聚集蛋白的选择性结合。

考虑到相对荧光强度和变化倍数,选定B7进一步研究的最佳探针。对聚集的DHFR中B7探针的光物理分析显示,B7荧光强度增加了28倍(图5b)。线性范围为0.45 ~ 25 μM,可以定量报告DHFR聚集(图5c)。B7探针对淀粉样蛋白聚集的选择性也被α-synuclein和转甲状腺素作为模型蛋白,在聚集时形成淀粉样原纤维(图5d)。硫黄素T (ThT)用于监测室温下72小时内α-synuclein淀粉样蛋白的聚集。除ThT外,α-synuclein形成淀粉样蛋白聚集后,A、B系列探针均无明显荧光增强。这些结果证实了B5-B9对无定形蛋白聚集体具有独特的选择性。此外,作者还通过测定mut-DHFR的甲氧苄氨嘧啶(TMP)稳定性,证明了B7在定量配体接触中的应用(图5f)。在不同的模型蛋白中,B7对淀粉样蛋白聚集具有选择性(图5g, 5h)。最重要的是,作者展示了B7在折叠蛋白存在的情况下,选择性地分裂成聚集蛋白(图5i, 5j),显示了其与聚集蛋白的内在结合亲和力。总的来说,B7对非晶态蛋白聚集物的选择性高于淀粉样蛋白聚集物。这些证据也支持EDG中的对氨基苯基在识别无定形蛋白聚集物中起重要作用。此外,作者证实了二苯乙烯连接的二甲氨基苯对识别无定形聚集物是必不可少的。

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5。对氨基苯基是识别蛋白质无定形聚集体的关键。

进一步研究复杂的细胞内环境,作者发现在使用MG132检测抑制蛋白体降解功能而引起的无定形态蛋白组聚集时,原始的B7 (E1)探针具有更高的细胞荧光背景(图6e)。作者认为这种高荧光背景是由于AIEgens的疏水效应和其固有的特性导致其溶解性差导致的自组装。因此,作者通过安装羟基生成了改善溶解度的E2和E3探针(图6a),以最小化这些AIEgen探针固有的自聚集特性。E2和E3对水的沉淀具有更强的抗性(图6b)。虽然三种探针在DHFR聚集时都保留了荧光增强,但作者观察到随着探针溶解度的增加,荧光强度和变化倍数之间存在权衡关系(图6c)。重要的是,E1在高浓度时溶解性差导致了明显的细胞毒性,而中位溶解性的E2具有最好的细胞相容性(图6d)。E2和E3在检测无定形蛋白组聚集时获得的细胞荧光背景都较少(图6e)。考虑到平衡的荧光强度、变化倍数、细胞相容性和背景荧光,作者选择E2作为进一步的活细胞应用。作者的结果也强调了平衡亲疏水性对最佳的细胞性能至关重要。

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9。平衡探针的亲脂性和溶解度,以优化检测蛋白质组聚集的细胞性能

与淀粉样蛋白传感器不同,蛋白质无定形聚集传感器由于缺乏靶向策略而很少被报道。在这项工作中,作者演示了如何从晶体诱导发射二氰异佛尔酮(DCI)支架中衍生荧光传感器,选择性地靶向蛋白质无定形聚集物。通过合理的设计和结构-荧光研究,作者发现了调节黏度和极性敏感性、与聚集蛋白的结合亲和性、荧光颜色和细胞性能的结构特征。作者的工作不仅提供了一个简单的工具来评估细胞的蛋白质沉积,而且补充了目前缺乏化学策略来靶向细胞内蛋白聚集。

原文链接:https://doi.org/10.1002/anie.202103674

 DOI: 10.1002/anie.202103674


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