分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章“Discovery of Highly Specific Catalytic-Site-Targeting Fluorescent Probes for Detecting Lysosomal PDE10A in Living Cells”。本文的通讯作者是中山大学的罗海彬教授和郭磊副教授，该课题组主要从事抗老年性痴呆、肺动脉高压、糖尿病、哮喘等药物靶标的结构生物学和发现研究，重点构建基于靶标磷酸二酯酶（PDE）的药物筛选体系，并进行相关的药物分子设计、有机合成和作用机制等研究。
磷酸二酯酶(PDEs)由于其在细胞内环核苷酸(cAMP和cGMP)水平的离散调控以及在复杂生理过程中信号和区段化的持续时间中的独特作用，而正被视为有前途的治疗靶点。由于PDE通过捆绑它们的信号体伙伴而被永久或可逆地招募到不同的亚细胞位置，因此，研究者可以通过给定PDE调控的环核苷酸信号精确地区分单个细胞中的多个亚细胞区域化的胞外和胞内信号。当考虑到PDE对特定疾病的治疗潜力时，确定一个给定的PDE的位置对理解其在整个生物系统中的催化活性至关重要。PDE10A作为一种在纹状体区域富集的、环核苷酸双特异性的PDE，能够以不同的相关性实现细胞内cAMP和cGMP水平的调节，进而作为中枢神经系统(CNS)疾病的潜在治疗靶点引起了相当大的关注。虽然许多PDE10A抑制剂已经被开发并用于中枢神经系统疾病的治疗中，但没有一种小分子可以作为可视化的探针，用于亚细胞PDE10A成像或跟踪研究中。本文中，作者通过深入了解PDE10A催化口袋活性位点的三维结构信息，设计了一种高效荧光探针(BVQ1814)。该探针以磷酸二酯酶10A为靶点，兼具高度亲和力和亚家族选择性。
为了获得一种理想的具有高抑制活性的荧光探针，作者选择了之前报道的PDE10A-14晶体复合物[Protein Data Bank (PDB) entry 7BPI]的支架，并基于3个方面的选择设计探针。首先，这种优越的支架必须与PDE10A的催化口袋的结构非常匹配，并有助于实现理想的受体-配体结合模式。该模式分为三个部分，即苯并咪唑片段作为供体，乙烯基连接体作为π共轭缀合物，喹啉基团作为受体。其次，该探针的刚性和π共轭支架必须具有触发发色团光学性质的能力。由于π共轭骨架的缺乏，几乎所有的PDE10A抑制剂都不能发出可见光。最后，需要在不降低抑制效价的情况下赋予抑制剂可见荧光，以及当分子结构被修饰时保持对PDE的选择性。借助分子对接和分子动力学(MD)模拟，作者精确地预测了硝基作为强吸电子组分而被引入喹啉基团的5号位，并由此设计并合成了BVQ1812、BVQ1813、BVQ1814和BVQ1815。结果显示，这些探针都与PDE10A催化口袋中的氨基酸残基有良好的静电相互作用。此外，合理设置在π共轭骨架上的硝基不仅增加了与Tyr514的氢键相互作用，而且增强了受体部分的吸电子效应，促进π-电子在整个π共轭体系中的离域发光。将探针合成之后对其抑制能力进行检测后，他们发现BVQ1814在体外对PDE10A表现出良好的结合亲和力，IC50值为0.91 nM，且对PDE10A的选择性为其他PDE家族的1000倍。接下来，作者说明BVQ1814能在活细胞中特异性检测到PDE10A，荧光信号显示大部分PDE10A可能分布在溶酶体中。作者进一步验证了PDE10A在稳定过表达mcherry-PDE10A的HepG2细胞中的分布。此外，该探针还能够实现PDE10A在组织切片中的轮廓的描绘，并显示了作为PDE10A抑制剂治疗肺动脉高压的显著疗效。这一概念将为充分利用目标物配体结合口袋中的结构信息设计追踪受体蛋白的高效荧光探针开辟新的途径。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00018文章引用：DOI：10.1021/acschembio.1c00018
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