为大家分享的是一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章，通讯作者是罗海彬。罗海彬是中山大学药学院教授、博士生导师、副院长，主要从事抗老年性痴呆、肺动脉高压、糖尿病、哮喘等药物靶标结构生物学和发现研究，重点构建基于靶标磷酸二酯酶（PDE）的药物筛选体系，并进行相关的药物分子设计、有机合成和作用机制研究。在本文中，作者通过研究磷酸二酯酶PDE10A的配体结合口袋的三维结构，设计了一种高效的、能与PDE10A特异性结合的荧光探针BVQ1814，这种探针兼有PDE10A抑制剂的功能，展现出了治疗肺动脉高压的可能性。
磷酸二酯酶PDE家族中的PDE10A，具有治疗中枢神经系统疾病和成为肺动脉高压的药物靶点的潜力，然而，目前对PDE10A的检测手段尚有许多缺陷：PET检测只能检测组织或器官水平的PDE10A含量，而研究PDE10A的亚细胞分布在先前只能在已被固定的细胞进行。而本文开发的荧光探针PDE10A克服了上述缺点，可以高效、特异性地与PDE10A结合，并实现对PDE10A亚细胞水平的实时检测，为研究PDE10A的亚细胞分布和以PDE10A为靶点的药物检测提供了帮助。在本文中，作者先基于PDE10A的配体结合口袋的三维结构设计荧光探针，并在细胞外检测其性质。基于作者之前在Protein Data Bank (PDB)发表的PDE10A-14晶体结构，作者针对PDE10A的催化口袋设计探针，以实现受体-配体结合的模式。该探针（BVQ1814）由三个部分组成：苯并咪唑片段作为供体，乙烯基接头作为π-共轭的连接子，喹啉部分作为受体；同时，该探针的刚性和π共轭支架使其具有发光的光学性质。此外，π-共轭支架上的硝基使探针与PDE10A的催化口袋的酪氨酸残基产生额外的氢键，同时也增强了受体部分的吸电子能力，促进了整个π-共轭系统中的π-电子离域，有助于可见光的产生。作者在细胞外测量了BVQ1814对PDE10A的半数抑制浓度及其选择性、光物理性质、BVQ1814与PDE10A的结合能力、BVQ1814与PDE10A络合物的解离半衰期。此外，通过将BVQ1814与Cy3 标记的PDE10A培养，发现有BVQ1814存在时在567 nm处发出很强的荧光峰，这一现象的原因是BVQ1814的FRET供体将其激发能量传递给Cy3的相邻FRET受体发色团，而这证明了BVQ1814与PDE10A的紧密结合。
探针BVQ1814与PDE10A的催化口袋的氨基酸残基的相互作用示意图及BVQ1814的相关性质
随后，作者检验了活细胞内BVQ1814产生荧光的效果。加入BVQ1814后，活Hela细胞中产生荧光，产生荧光的位置与加入LysoTracker Red产生的红色荧光（图1B）重合，而LysoTracker Red可以标记细胞溶酶体的位置。这说明PDE10A的亚细胞分布主要在细胞溶酶体。使用PDE10A siRNA使PDE10A表达沉默、使用TAK-063（PDE10A抑制剂）处理后，BVQ1814产生的荧光强度均下降。使用氯喹处理使溶酶体pH升高后，BVQ1814产生的荧光强度改变不大。综上，上述实验证明了BVQ1814是通过与PDE10A相互作用产生荧光，而非仅仅在溶酶体内堆积产生荧光。使用含有mCherry蛋白荧光报告基因标记PDE10A的mCherry-PDE10A-过表达HepG2活细胞，标记溶酶体的LysoTracker Green产生的荧光与mCherry标记的PDE10A产生的荧光相关性很高（皮尔逊相关系数为0.87），此外，BVQ1814与mCherry荧光蛋白标记的PDE10A相关性也较高（皮尔逊相关系数为小于等于0.84）这一对PDE10A的亚细胞分布的研究对原先认为的PDE10A储存在高尔基体中，通过磷酸化进入胞质的信号转导方式的假说提出了异议。根据BVQ1814对PDE10A亚细胞分布的实时监测，大部分PDE10A实际上分布于溶酶体。
然后，作者使用了使用BVQ1814对PDE10A在组织切片中染色。MCT诱导的大鼠肺组织中PDE10A蛋白的表达可以被BVQ1814识别，与PDE10A抗体的红色标记在肺动脉内皮中共定位。因而，BVQ1814的绿色荧光也可以用于识别肺动脉内皮的过度增殖。
BVQ1814对小鼠肺部组织切片染色
最后，作者进行了BVQ1814抗肺动脉高压的药物学作用的动物实验。使用MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型，使用BVQ1814处理两周后，小鼠的平均肺动脉压和右心室肥大指数相比对照组均下降，组织切片显示其肺小动脉内侧壁厚度也下降。此外，BVQ1814在极性毒性测试中表现出低毒性，这为其成为抗肺动脉高压药物成为了可能。
BVQ1814对肺动脉高压小鼠的治疗效果及毒性
综上，作者利用PDE10A的催化位点的三维结构，设计出了高特异性、荧光效率较高的探针BVQ1814，并在体外检测了这一探针的光学、动力学等性质。同时，使用这一探针，实时检测了PDE10A的亚细胞分布，并研究了BVQ1814标记组织、作为抗肺动脉高压药物的可能性。这一研究为基于蛋白三维结构的荧光探针设计、PDE10A在信号转导途径作用研究、肺动脉高压状况的监测与治疗均提供了思路。
文章作者：CZH
原文引用：10.1021/acschembio.1c00018
责任编辑：HBQ
原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00018
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