本次阅读的文献是Andrey S. Klymchenko教授课题组发表在JACS上的文章。

生物膜构成了活细胞所有隔间的基础，因此，监测它们的脂质组织是了解细胞状态和活性的必要条件。本文作者设计了一系列基于尼罗河红配体的溶剂变色探针，用于内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体、质膜和脂滴的特异性靶向。这些极性敏感探针通过改变它们的最大发射量来检测脂类顺序的变化。在与参考细胞器标记的共定位显微镜实验中，它们表现出良好的细胞器选择性。使用双色荧光显微镜，新的探针可以成像活细胞中细胞器的局部极性。为了排除探针设计对膜特性敏感性的偏置影响，作者在显微镜下对模型膜中的所有探针进行了校准，从而首次对每个目标细胞器中的脂质顺序进行了定量描述。胆固醇提取证实了探针感知脂质顺序的能力，揭示了缺乏胆固醇的细胞器特别受其富集的影响。这些探针还显示，氧化和机械应激导致了每个细胞器特有的局部极性和脂质顺序的变化，线粒体和溶酶体对应激特别敏感。新的探针可以在单个细胞器的膜水平上监测细胞对物理和化学刺激的反应，这在细胞研究中仍是一个有待探索的方向。

作者将一个尼罗河红色荧光团与靶向部分结合(图1A)，获得了溶致变色细胞器特异性探针。之前已经报道了用十二烷基磺酸盐(探针NR12A)对尼罗河红进行质膜靶向。用尼罗河红染料的氨基端偶联比用酚基团偶联提高了性能，因此作者对所有的细胞器靶向探针都选择了氨基端偶联策略。为了靶向线粒体，作者使用了三苯基膦，已知三苯基膦在跨膜电位的驱动下通过线粒体内膜聚集在线粒体内。N-烷基吗啉部分，在生理pH值存在可逆的质子化，被用于溶酶体。氯丙基和五氟苯基用于靶向ER，肉豆蔻酸用于靶向高尔基体。为了提高尼罗河红与脂滴的亲和力，作者将其嫁接到两个环己基上。所有的探针都是从先前报道的含羧酸的尼罗河红衍生物(NR-COOH)开始合成的。产物通过酰胺与相应的靶向配体偶联得到中等到良好的产量(图1)。

由于尼罗河红色部分的亲脂性，所设计的探针有望通过其特征发射波长报告特定细胞器生物膜的局部极性和脂序。此外，它们有望感知细胞器生物膜中的胆固醇含量，由于脂质过氧化导致生物膜极性改变而引起的氧化应激和机械应激相关的细胞器膜脂序改变而引起的高渗透休克(图1C)。

图 1 基于尼罗河红的溶剂致发光靶向探针。

在不同极性的有机溶剂中，所有新探针都表现出了高荧光量子产率和溶剂化变色的移动，其带位与母尼罗河红相似，这表明荧光团保留了其光学性质，包括溶剂化变色。然后，作者在大型单片膜囊泡(LUVs)中研究了探针，这是不同组成的模型脂膜，呈现Ld相(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DOPC, DOPC/Chol)和Lo相(SM/Chol)。在DOPC LUVs中，所有的探针都表现出荧光增强，与缓冲相比具有良好的量子产率，并伴有在640-650 nm左右的发射蓝移 (图2)。这些结果表明，所有被研究的探针都能很好地划分到Ld相中，与水相比，它们在Ld相中能感应到较低的极性。总的来说，新的探针可以结合脂质膜，并且区分Lo相的极性比Ld相少得多。

图 2  探针NRlyso、NRGolgi_E、NRER_Cl和NRMito在不同成分的脂囊泡(LUVs)中的荧光发射光谱。探针浓度为2 μM，总脂浓度为1 mM，激发波长为520 nm。

为了评估探针针对目标细胞器的能力，我们将其与活KB(图3)和HeLa细胞以及相应的细胞器标记一起孵育。每个新的探针在两个细胞系中都显示出与相应的商业标记的显著共定位，在KB细胞中的皮尔逊相关系数值在0.89到0.96之间((除了NRGolgi_E显示的值稍低)。在这两种细胞系中，探针NRLyso比商业溶酶仪绿色表现出更高的选择性，从图像中观察到的低背景噪声可以清楚地看出这一点(图3E)。此外，与母体尼罗河红染料相比，HeLa细胞中的NRLD对脂滴表现出更高的选择性，这可能是因为二环己基氨基具有更高的疏水性和大体积。

图 3 溶致变色探针(红色)与商业细胞器探针(绿色)在活KB细胞中的共定位。

尼罗红的发射光谱带的位置描述了极性脂质结构和顺序。在细胞分析之前，每个探针在模型脂膜(LUVs)的显微镜下进行校准，呈现Lo和Ld相，对应于脂膜有序和无序的极端例子。在NRLD探针的情况下，用芝麻油代替Lo相囊泡，以模拟LDs油核中的非极性环境。当比较Ld和Lo相时，LUVs的比率荧光显微镜(表现为均匀信号，因为在这个时间尺度上单个囊泡无法分辨)显示探针的伪色有很大的差异(图4A)。事实上，Lo相的绿色/红色荧光强度比更高，这与光谱观察到的发射光谱中的蓝移相对应(图2)。然后，作者分析了图像中绿/红强度比的分布(图4C)，进一步得到了平均比值值(图4D)，这使得作者可以量化探针对Ld-Lo相变的比率响应幅度。各探针的比值值及其随相变的变化都具有特征，与上述光谱数据一致。有了Ld和Lo期的校准数据，作者对活KB细胞进行了比率成像(图4B)。引人注目的是，假色在不同的细胞器中表现出巨大的变化，这反映了强烈的绿色/红色比例的差异（图4C，D），从而反映了局部极性的差异。的确，在线粒体和内质网中观察到的橙色伪色表明了最极性的微环境，而脂滴和蓝绿色质膜中的蓝紫色点则反映了较低的局部极性(图4B)。

溶剂化变色染料检测到的局部极性反映了生物膜的脂质序:脂质序越高(脂质堆积越紧密)，局部极性越低，水合作用越强。为了从脂质顺序上解释这些局部极性变化，作者将细胞中的绿/红比率与LUVs校准图像中的比率进行了比较(图4C，D)。质膜探针的比值接近LUVs的Lo期比值，ER和高尔基(NRERF和NRGolgiE)的比值接近Ld期比值。为了定量描述这一效应，作者引入了一个脂序参数，LOP = (R - RDOPC)/(RSM/Chol - RDOPC)，当绿红比(R)接近Ld (RDOPC)和Lo (RSM/Chol)相LUVs时，该参数分别接近0和1(图4E)。经分析，质膜脂质水平最高，接近SM/Chol，与前期研究一致。胞内细胞器的LOP值明显降低，依次为:NRMito ~ NRER_Cl >NRLyso>NRGolgi_E>NRER_F。两种探针，在染色内质网(NREL_Cl和NREL_F)时显示出非常不同的局部脂质顺序，可能是由于NREL_F荧光团在内质网膜内的插入较浅。在LDs中，由于LDs的核-壳结构不同于脂质双分子层，所以不采用LOP定量。LDs (NRLD)的绿/红比值值与芝麻油中的值接近(图4C)，反映了LDs油芯的非极性环境。

图 4  溶致变色细胞器特异性探针显示了KB细胞细胞器内极性和脂质顺序的差异。(A)显示Lo (DOPC)和Ld (SM/Chol)相的LUVs的比率共焦成像校准探针(NRLD时，使用芝麻油代替SM/Chol LUVs)。(B)溶剂变色细胞器探针对KB细胞的比率共聚焦成像。(C)相应探针在KB细胞中绿色/红色荧光强度比(I_550-600 / I_600-650)的分布直方图。(D) LUVs和细胞成像数据得到的I_550-600 / I_600-650比值的加权算术平均值(A,B)。(E)各种条件下KB细胞和LUVs中细胞器探针的比率图像计算的脂序参数(LOP)。

将细胞暴露于过氧化氢(H₂O₂)可诱导氧化应激，这可能会由于脂质过氧化而改变细胞器膜的极性。首先，与参考细胞器标记的共定位成像实验证实，H₂O₂处理不影响新探针的细胞器特异性。第二，与过氧化氢处理后，改变比率计的伪彩色图像中以不同的方式研究了细胞器，反映绿色/红色比率(即当地极性)改变(图5A)。在LDs、溶酶体和线粒体中检测到极性最明显的增加(绿色/红色比例下降)(图5B)。LDs的较高反应与之前的研究结果一致，表明这些细胞器对氧化应激具有较高的敏感性，这可能与大量易氧化的不饱和脂有关。对于溶酶体，处理也导致极性显著增加，可能是因为溶酶体内部来自细胞外培养基，因此这些细胞器高度暴露在H₂O₂的作用下。观察到的溶酶体极性值的异质性增加(强度比分布变宽，图5B)与文献数据一致。线粒体极性的增加与文献中有关线粒体对氧化应激的高敏感性的数据密切相关，氧化应激与衰老和凋亡直接相关。根据LOP分析，氧化应激显著降低了溶酶体和线粒体的脂质序，且LOP值达到了提取胆固醇后的值。质膜变化较低，可能是由于大量饱和脂质，不易氧化。NRER_Cl，特别是NRGolgi_E的极性较完整细胞明显下降。对于NRGolgi_E来说，这种减少是出乎意料的，可能与氧化应激导致饱和脂和胆固醇含量增加有关。此外，氧化应激可以改变探针在细胞中的定位，即使根据共定位数据，它们通常仍停留在目标细胞器中。总的来说，氧化应激在整个细胞的细胞膜上产生了显著的极性/脂质顺序的改变，在不同的细胞器中反应强烈不同。

图 5 (A)使用溶剂致变色探针对氧化应激下活KB细胞进行共焦比率成像。2 mM过氧化氢(37℃下1h)产生应力。探针浓度:NR12A为20 nM;50 nM的NRMito, NRLyso, NRLD和NRER_Cl;200nm NREL_F;5 μM (BSA -共轭形式)的NRGolgi_E。(B)相应探针在KB细胞中绿色/红色荧光强度比(I_550-600 / I_600-650)的分布直方图。

在高渗透胁迫诱导下，质膜(用NR12A染色)表现出了形态上的变化，产生了锯齿状的图案，与末端相比，内部部分出现了更多极性(和更无序)的区域(图6)。这可能是由于细胞收缩导致细胞膜最移位部分脂质顺序下降所致。这些观察结果与之前的结果是一致的，因为相比最外面的部分，这些质膜的最里面的部分似乎经历了更多的变形，可能是通过拉伸。在细胞末端，收缩是有限的，可能是由于存在刚性的细胞骨架丝。

图 6  (A)高渗透冲击下活KB细胞的共聚焦比成像，使用溶剂致变色探针对细胞器进行成像。电击是用1 M蔗糖溶液替代一半的培养基产生的。

(B)相应探针在KB细胞中绿色/红色荧光强度比(I550-600 / I600-650)的分布直方图。

在本工作中，作者合成了一组基于尼罗红的细胞器靶向溶剂致变色荧光探针。总的来说，所开发的内质网、线粒体、高尔基体、脂滴、溶酶体和质膜的探针能够选择性的细胞器靶向并感知局部极性，揭示了它们在脂质顺序上的细微差异。由于作者使用相同的溶剂变色染料，可以直接比较不同细胞器的局部极性，从而建立以下趋势:脂滴式隔膜≪质膜≪高尔基<溶酶体<< span="">ER<线粒体<< span="">ER(带有浅探针NRER_F)。然而，每个探针都有不同的化学设计，报告了即使是相同的脂膜模型也有轻微的局部极性差异，这在脂囊泡的光谱学和显微镜数据中得到了证明。因此，为了直接比较不同细胞器中的脂质顺序，作者开发了一种方法，通过对模型脂质双分子层的有序相和无序相的探针进行校准，将观察到的局部极性转换为定量的脂质顺序参数。这一方法首次对不同细胞器生物膜的脂质顺序进行了定量比较，揭示了以下趋势，与基于局部极性的趋势略有不同:质膜≫线粒体∼ER>溶酶体>高尔基体>ER(带有浅探针NRERF)。所有的新探针都显示出对胆固醇消耗和富集的比率反应，从而证实了探针在所研究的细胞器生物膜中感知脂质序。此外，胆固醇富集的影响在缺乏胆固醇的细胞器中特别强烈，如内质网和溶酶体，而在富含胆固醇的质膜中，这种影响非常小。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.0c10972

DOI: 10.1021/jacs.0c10972