分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章：One Stone, Three Birds: pH Triggered Transformation of Aminopyronine and Iminopyronine Based Lysosome Targeting Viscosity Probe for Cancer Visualization。

1. 探针1的合成

文献报道，可以通过增加氨基的电子给体强度来改善氨基派若宁的稳定性。因此，选择了一个强的供电子基团二乙氨基作为荧光团，通过将蒽酮与三氟甲磺酸酐和苯胺合成探针1。

2. 探针1的光学传感特性

首先检测了粘度敏感性，探针1在有机溶剂（DCM, EA, THF, DOX, DMSO, DMF, EG, EtOH, ACN, MeOH, PBS和甘油）和水中的发射光谱。在水和其他有机溶液（包括弱极性溶剂（DCM, EA, THF和DOX）和高极性溶剂（DMSO和ACN）以及质子溶剂（MeOH, EtOH和EG）中，基本上观察到不发荧光。但探针1在甘油中的量子产率显著高于在其他溶剂中观察到的量子产率（图1A所示）。这些结果表明探针1具有高的粘度选择性。此外，与水相比，甘油中探针1的荧光强度增加了50倍。且荧光量子产率和寿命随着粘度的增加而增加。实验结果均表明探针1能够定量指示粘度。

图1.探针1的光学特性

接下来检测对pH的响应。测试了探针1在pH为2-12的缓冲溶液中的吸收。图1C所示，在pH范围2-5中，探针1的主要吸收位于460 nm处，在pH范围6-12中逐渐蓝移至365 nm。图1D中显示了探针1在不同粘度和pH溶液中的荧光强度。当pH保持恒定时，探针1的荧光强度随粘度的增加而增加；在相同粘度下，探针1的荧光强度随pH的降低而增加。仅在低pH和高粘度系统中检测到强荧光。这些结果表明，只有通过pH和粘度的联合作用，才能有效地激活探针1的强荧光。

3. 探针1在活细胞中溶酶体的荧光成像

首先，通过MTT分析确定探针1的细胞低毒性。然后进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验以检查探针1在活细胞中的成像性能。在不加探针1的情况下活HepG-2细胞不显示荧光，在与探针1孵育后（5分钟以内）显示黄色荧光。此结果表明探针1表现出良好的膜渗透性。之后进行了共定位成像实验以检查探针1的细胞内定位。用探针1预处理后，将活HepG-2细胞分别与商品化的溶酶体深红色荧光染料LTDR，线粒体特异性荧光染料MTDR和细胞核荧光探针Hoechst 33342一起孵育。探针1和LTDR的Pearson相关系数为0.90（图2）。这结果表明探针1主要位于细胞的溶酶体中。

图2. 探针1对溶酶体的特异性成像

通过共聚焦显微镜选择3T3，HL-7702，HepG-2，SMMC-7721、4T1和HeLa细胞进行荧光成像。正常细胞（3T3和HL-7702）和癌细胞（HepG-2，HeLa，4T1和SMMC-7721）用探针1（4μM）染色20分钟，并且癌细胞的荧光强度更强图3所示。癌细胞的平均荧光强度比正常细胞高2.3倍。因此，结果表明探针1能够基于溶酶体pH和粘度的差异将癌细胞与正常细胞区分开。

图3. 探针1对肿瘤细胞和正常细胞的成像

4. 使用探针1可视化肿瘤组织

在体外实验中，探针1能够将癌细胞与正常细胞区分开，推测可以将肿瘤与正常组织区分开。建立了HepG-2细胞的荷瘤小鼠，然后将心，肝，脾，肺和肾以及肿瘤组织取出，如图4所示，在与探针1（4μM）孵育0-30分钟后，在心，肝，脾，肺或肾中未观察到明显的荧光。与之形成鲜明对比的是，孵育20分钟后，肿瘤组织显示出比器官明显更亮的荧光。表明探针1可用于快速响应和高选择性肿瘤可视化。

图4. 探针1对体外各组织器官及肿瘤组织的成像

进一步评估了探针在肿瘤诊断中的应用。通过尾静脉向荷瘤小鼠注射探针1（50μM，50μL）。20分钟后，分离器官和肿瘤并成像。如图5所示，器官显示弱荧光，而肿瘤组织显示高强度荧光。

有趣的是，尽管许多用于癌症成像的荧光探针都受到肝脏和肾脏的干扰，但通过比较荧光强度可以很容易地将肿瘤与器官区分开。如前所述，探针1仅在酸性和高粘度条件下显示强荧光。考虑到癌细胞中溶酶体的较低pH和较高粘度，探针1对肿瘤组织的高选择性可能是酸活化和粘度感应的结果。因此，由于pH引发的氨基派若宁和亚氨基派若宁的转化以及对TICS过程的粘度依赖性抑制，肿瘤在正常器官上应该表现出更强的荧光。而正常器官的溶酶体pH值较高，黏度较低，因此，荧光较弱。这些结果进一步表明，探针1可以作为一种有效的工具，具有高选择性的肿瘤可视化。

图5. 探针1对体内组织器官及肿瘤组织的成像

总而言之，作者开发了一种溶酶体靶向探针，该探针根据粘度和pH值的差异，可将癌细胞和肿瘤与正常细胞和器官区分开。