Chem. Commun.｜基于丙氨酸氨基肽酶过表达检测肾损伤的近红外荧光探针

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分享一篇2023年发表在Chem. Commun.上的文章，题目为“A NIR fluorescent probe for the detection of renal damage based on overrepresentation of alanine aminopeptidase enzyme”。文章的通讯作者为瓦伦西亚理工大学的Ramón Martínez-Máñez。

肾脏的主要功能是过滤血液中的废物，并清除多余的水分，维持盐和矿物质(如钙、磷、钠和钾)的平衡，控制血压，从而维持身体的稳态。肾脏非常敏感，很容易受到损伤，导致肾纤维化。急性肾损伤通常由氮代谢最终产物(尿素和肌酐)的积累以及尿量的减少共同诊断。然而，血清肌酐不能用作敏感的早期生物标志物，因为肾小球滤过率至少降低50%才能检出血清肌酐，而且肌酐转化为血清水平的提高有明显滞后。此外，血清肌酐水平还受到多个变量的影响。同样，血清尿素水平可能会在某些条件下增加，限制了它作为肾损伤的生物标志物。除了血清肌酐或尿素水平的改变外，肾脏损伤也引起尿中丙氨酸氨基肽酶(APN)的过度表达。当肾上皮受损时，丙氨酸氨基肽酶被释放并分泌到尿液中。因此，尿液中的APN可以作为肾脏损害的早期生物标志物。尼罗蓝(NB)是一种低成本的商业荧光团，其发射波段集中在近红外区(NIR)。在此基础上，作者开发了一种基于尼罗蓝(NB)的荧光探针NB-ALA用于检测APN。NB-ALA能灵敏、选择性地检测水溶液和掺杂尿液中的APN。在小鼠急性肾损伤模型中，NB-ALA直接在尿液中荧光检测APN（图1）。

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图1.NB-ALA探针通过尿液样本检测肾损害的示意图。

NB-ALA在被APN水解后，NB被释放(图2A)。 NB-ALA在530 nm处激发后，在630 nm处出现弱的发射。在APN的存在下，630 nm处观察到10倍的发射增强(图2B)。这种发射增强是由于APN诱导NB-ALA探针的水解，产生了游离NB。HPLC-MS证实了上述的水解反应。探针的色谱图在6.02分钟显示了一个单峰，而在酶存在15分钟后，该信号的强度降低，随后在5.47分钟出现了一个新的峰，加酶30分钟后，NB-ALA 6.02分钟的峰完全消失，证实了探针的完全水解(图2C)。

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图2.(A)APN诱导NB-ALA探针的水解示意图。(B)添加APN 30分钟后，NB-ALA+ APN和NB-ALA的荧光发射曲线。(C)水溶液中游离NB- ALA(蓝色)、游离NB（红色)和添加APN 15分钟(黑色)和30分钟(绿色)NB-ALA+ APN的色谱图。

将不同浓度的APN加入NB-ALA 溶液中，在37℃下反应30分钟后记录发射光谱(λexc = 530 nm)。以ALA-7-氨基-4-甲基香豆素(AlA-AMC)为参考底物，计算APN的活性。如图3A所示，APN诱导NB-ALA水解并释放游离NB，观察到发射强度与添加APN的量成正比。根据这些数据，计算出APN的检出限。此外，对NB-ALA水解进行了动力学研究，在没有APN的情况下，NB-ALA的荧光发射保持稳定，添加APN后，在630 nm处，荧光增强在约30分钟内达到最大(图3B)。最后还测试了NB-ALA的选择性，只有在APN存在的情况下，才能在630 nm处观察到明显的发射增强(图3C)。

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图3.(A)在不同浓度APN的水溶液中，NB-ALA的荧光发射光谱。(B) NB-ALA在无APN和存在APN的不同时间点上的荧光强度(C) NB-ALA的选择性研究。

接下来作者研究了NB-ALA在临床环境中检测APN的能力。健康人尿液中APN的浓度可以忽略不计。将NB-ALA加入到不同浓度APN的人尿液样品中，在37℃反应30分钟后记录荧光信号(图4A)。APN的增加与APN的添加量直接相关，根据得到的校准曲线(图4B)，计算出尿中APN的检出限。随后，在尿液样品中加入不同浓度的APN，加入NB-ALA，并在37°C下反应30分钟。测量630 nm处的发射，并根据图4B所示的校准曲线计算APN浓度。

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图4.(A)不同浓度APN反应30分钟后，人尿液样品中NB-ALA的荧光发射光谱。(B)尿液中APN浓度校准曲线。

为了测试NB-ALA在临床前环境中检测内源性APN的能力，作者对急性肾损伤和纤维化小鼠的尿液样本进行了评估。小鼠一次性腹腔注射高浓度叶酸(FA)可以引起急性肾损伤。分别在注射FA后0天(对照，CTR)、7天和15天收集FA处理小鼠的尿液样本(图5A)。为了分析动物模型，对小鼠实施安乐死，采集肾脏，组织切片石蜡包埋，进行染色，以可视化和量化纤维化(图5B、C )。CTR小鼠没有出现皮质纤维化的迹象，而小鼠在接受FA治疗7和15天后出现了皮质纤维化。为了评估纤维化是否导致肾功能下降，作者收集了尿液，并测量了尿液密度，结果显示，在FA治疗7天和15天后，动物样本的尿液密度显著下降，这证实了肾功能衰竭(图5E)。为了通过APN检测验证NB-ALA在肾衰竭诊断中的有效性，取0、7和15 d的尿液样品，分别用最终浓度为20 μM的NB-ALA处理，在37℃孵育30 min，然后在630 nm (λexc = 530 nm)测定荧光发射信号。在未对尿液进行任何处理的情况下进行荧光测量。在FA处理后7天的尿液样本中发现了显著的荧光信号差异(6倍)，FA处理后15天的尿液样本显示增强了11倍(图5F)。这些实验表明NB-ALA可以用于肾损伤小鼠模型的检测。

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图5.FA致肾损伤小鼠尿液中NB-ALA的检测。(A) FA诱导肾损伤实验过程的时间轴。分别于第0、7、15 d后采集小鼠尿液(点尿)并处死。(B)收集肾脏，石蜡包埋，切片并染色。C)肾纤维化定量。(D)血清尿素的定量。(E)尿密度测量。(F)尿样中NB-ALA的荧光发射强度。

综上所述，本文介绍了一种用于APN检测的近红外荧光探针NB-ALA。NB-ALA具有很弱的发射，但在APN存在下，NB-ALA被水解，释放出高发射的NB荧光团。NB-ALA在水溶液和APN掺杂的人类尿液样本中均具有检测功能。此外，NB-ALA探针在FA诱导的小鼠肾纤维化模型中得到验证。NB-ALA探针对APN的敏感性和选择性决定了其在肾损伤检测应用的潜在价值。

原文链接：https://doi.org/10.1039/D2CC05408F


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