ACS Sensors┃基于小分子探针对活神经元中同型半胱氨酸的选择性、快速和比例荧光传感

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分享一篇2022年发表在ACS Sensors上的文章,题目是“Selective, Rapid, and Ratiometric Fluorescence Sensing of Homocysteine in Live Neurons via a Reaction-Kinetics/Sequence-Differentiation Strategy Based on a Small Molecular Probeg”。文章的通讯作者为华东师范大学的张琪伟教授和田阳教授。

小分子生物硫醇(biothiol),如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),是含有巯基的天然化合物,在调节蛋白质合成、解毒等一系列生理和病理过程中起着重要作用。这些生物硫醇的重要生理功能激发了人们对开发用于检测和成像 CysGSH  Hcy 的有效方法的浓厚兴趣。在目前开发的方法中,荧光探针被认为是最有前途的生物分析物监测和细胞内成像技术,因为它们具有高分辨率和灵敏度、操作简单以及非侵入性。迄今为止,已经实现了一系列用于检测生物硫醇的荧光探针;然而,它们主要是检测 GSHCys  Cys  Hcy 的总和,而由于 Hcy 含量相对较低,结构和反应性均一性较高,因此无法将 Hcy 与其他两者进行特异性区分半胱氨酸。因此,开发新的有效策略来设计能够在生理环境下进行高选择性、高灵敏度和快速响应的Hcy检测的荧光探针仍然是一项紧迫而艰巨的任务。

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 1. (A) DCB合成路线和参考化合物结构的示意图。(B) 探针DCB X 射线单晶结构及其分子堆积。(C) DCB分别针对 HcyCys GSH的拟议反应机制

在这项工作中,作者开发了一种基于双结合位点硼-联吡啶 (BODIPY) 荧光团DCB 的反应动力学/序列分化策略(图 1 AB),它避免了上述所有缺陷并满足要求用于快速定量检测活细胞中的同型半胱氨酸。 探针DCB能够有效区分HcyGSHCys,检出限低,线性检测范围足够,比率荧光输出在单通道可见光激发下快速响应(50 s以内),从而实现精确和实时检测活细胞中的 Hcy。(图1

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 2. (A)添加 Hcy0–80 μM,每次添加反应 1 分钟)后DCB (10 μM)的吸收响应。(B)在存在 CysHcy  NAC 的情况下参考化合物7和探针DCB的归一化吸收光谱(处理时间分别为 2 小时、分钟和 7 小时,以达到平衡)。所有测量均在乙腈/PBS5:95v/v10 mMpH 7.4)中进行。

首先,作者研究了探针DCB对三种生物硫醇的反应机制及Hcy的特异性鉴别。鉴于它们的同源结构和相似的化学性质,比较研究了DCB Hcy  Cys的反应。如图2A所示,游离探针DCB502 nm处的主要吸收逐渐降低,而在522 nm处出现一个新峰,并随着Hcy的增加而增加。存在 Cys DCB的吸收光谱与氨基连接的参考化合物7的吸收光谱非常匹配(图 2 B)。而对于 Cys,氨基取代产物(DCB -N-Cys) 通过取代-重排程序形成 ( 1 C)。随后,评估了探针在体外对 Hcy 的选择性和比例荧光检测。

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3. (A) DCB探针 (10 μM) 共孵育的神经元的共聚焦荧光显微图像,随后进行不同时间的 OGD 处理(a1–a3 g1–g3 0–60 分钟)。(h1–h3) 代表先用OGD 处理 60 分钟,然后用氧气和葡萄糖培养 60 分钟,然后用DCB 探针 (10 μM) 孵育 10 分钟的神经元的共聚焦荧光显微图像。(B) 从面板a3–h3 获得的F红色/ F绿色的平均值。激发波长为405 nm。比例尺 = 20 微米。

据报道,中风是全球第二大死亡原因和身体残疾的主要原因。考虑到Hcy在缺血性脑卒中中的重要作用,研究神经元中Hcy水平与脑缺血的关系,对于理解缺血性脑神经元损伤的生理病理过程有很大帮助。作者通过使用氧-葡萄糖剥夺 (OGD) 策略对缺血性损伤的细胞模型进行了实验。探针DCB用于检测和成像用 OGD 处理不同时间的神经元中的 Hcy 水平。如图6A所示,随着OGD处理时间的延长,绿色通道的荧光强度明显减弱,而红色通道的荧光强度逐渐增强,呈比例变化。F red / F green的值在实验条件下持续增加(图 6 B,在 ODG 处理 0-60 分钟内),这无疑反映了 OGD 处理下神经元中 Hcy 的积累。然而, F red / F green显着下降在恢复氧气和葡萄糖供应后观察到该值,表明神经元中 Hcy 水平的恢复(图 6 A h1–h3 和图 6 B)。这些结果清楚地表明,缺血可能是导致活神经元中 Hcy 水平快速升高的一个因素。考虑到高 Hcy 的一系列毒性作用,包括过度刺激谷氨酸受体导致细胞质钙和自由基水平升高,以及导致蛋白质表达异常导致 Cys  GSH 功能障碍,从而降低抗氧化应激和组织修复能力作者推测,缺血诱导的神经元内 Hcy 升高和由此产生的神经毒性可能是缺血性中风背后的分子机制之一。

综上所述,作者开发了一种基于 BODIPY 的荧光探针DCB,该探针可根据三种生物硫醇的不同反应性和结构,通过比率荧光响应模式有效地将 Hcy  Cys  GSH 区分开来。本文不仅为 Hcy 检测和成像提供了一种有效、准确且响应快速的探针,而且揭示了 AD 和中风病理对神经元内 Hcy 代谢的关键影响,加深了对这些生理和病理过程的理解细胞水平的神经系统疾病。

原文链接:https://doi.org/10.1021/acssensors.1c02684


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