分享一篇2020年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章,题目是“Chemoproteomic profiling of itaconation by bioorthogonal probes in inflammatory macrophages”。文章的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院王初课教授。
衣康酸结构中含有活性的α,β不饱和酮结构,可以和蛋白表面的半胱氨酸残基发生共价修饰,从而改变蛋白的结构和功能,发挥生理作用。作者前期已经报道了通过基于S-糖基化的竞争性探针去间接捕获衣康酸靶点,并发现和验证了ALDOA、LDHA等关键糖酵解代谢酶,但是这种间接的方法只能运用于裂解液水平,因此,作者继续深入研究,通过设计衣康酸探针,开发了可以直接运用于活细胞水平的衣康酸靶标发现新方法。
图1. itaconate-alkyne (ITalk)探针的设计与评价。作者首先针对衣康酸的结构设计化学探针,在保留活性基团的基础上,引入一个炔基,命名为ITalk。炔基的引入对衣康酸的活性没有影响,同时能够和代谢物形成有效的竞争。图2. ITalk概括了itaconate的功能。ITalk除了和衣康酸具有相似的半胱氨酸反应活性外,在LPS刺激的Raw264.7细胞模型中,ITalk可以显著抑制白介素1β(IL-1β)的分泌,其药效与OI相似。另外,ITalk可以调节糖酵解通路中的代谢物利用,葡萄糖的消耗和乳酸的产生减少。因此,ITalk是衣康酸的功能类似物。同时,ITalk在100uM,12h标记条件下,在BMDM、Neuron、A549细胞系中均可实现活细胞标记,且无明显的细胞毒性。另外,作者在细胞中过表达衣康酸的3个已知靶标:KEAP1、ALDOA、LDHA,并通过ITalk成功的捕获到这三个靶蛋白,说明通过ITalk可以实现细胞上直接发现衣康酸的未知靶点。图3. 炎症巨噬细胞中itaconate修饰蛋白的化学蛋白质组学分析作者在LPS刺激的巨噬细胞中,给予100uM ITalk探针12h,再通过基于CuAAC反应的化学蛋白质组学技术对衣康酸修饰靶点进行富集和检测,最后选择富集后丰度提高10倍以上,且至少有2个生物学重复的蛋白作为候选靶点,共计1926个。之前通过糖基化探针竞争半胱氨酸鉴定到的231个衣康酸靶点,有78%(181)被ITalk探针捕获到,其中包括KEAP1、ALDOA、LDHA。另外,作者对DDB1、GSN、ACLY、AK2这4种蛋白与ITalk进行了结合验证。作者想进一步区分衣康酸靶标的活性。在细胞上用ITalk标记1h和10h,再分别用甲基化进行轻重标,最终定量出1686个蛋白,其中199个蛋白为高反应活性靶点(即标记1h即达到饱和),这些蛋白主要聚集在转录和脂肪酸β氧化通路中然后作者通过TOP-ABPP的方法进一步鉴定炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰位点,共鉴定出862个蛋白、1131个位点,且存在18个赖氨酸和8个组氨酸ITalk修饰。其中,多个与炎症应答和自身免疫防御相关的蛋白存在衣康酸修饰,这表明衣康酸通过多条通路调节巨噬细胞的功能。图4. ITalk在炎性巨噬细胞中对衣康酸底物的位点特异性分析。作者对上述通路中的衣康酸修饰位点进行了验证。BRI3B和WIPI3位点突变后,ITalk无法标记,而RIPK3的3个修饰位点中,只有C360突变后会导致ITalk标记效率下降。RIPK3的激活与necrosis(一种程序性坏死过程)相关,通过激活MLKI启动。而衣康酸和OI可以促进RIPK3 S323位点和底物MLKI的磷酸化,C360位点突变后,衣康酸对RIPK3的调节作用消失,说明衣康酸通过C360位点激活RIPK3信号。综上所述,作者在前期设计了S-糖基化竞争性探针,运用间接法大规模鉴定衣康酸靶点后,进一步拓展研究,设计了ITalk探针,可以直接捕获衣康酸修饰靶蛋白,并且实现了活细胞标记,加深了我们对衣康酸在巨噬细胞炎症中生理作用的理解,同时对探索衣康酸在其他疾病模型中的作用奠定了基础。原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b11962
目前评论: