​J. Am. Chem. Soc.┃炎症巨噬细胞衣康酸化修饰的生物正交探针用于化学蛋白质组学分析

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分享一篇2020年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章,题目是“Chemoproteomic profiling of itaconation by bioorthogonal probes in inflammatory macrophages”。文章的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院王初课教授。

衣康酸结构中含有活性的α不饱和酮结构,可以和蛋白表面的半胱氨酸残基发生共价修饰,从而改变蛋白的结构和功能,发挥生理作用。作者前期已经报道了通过基于S-糖基化的竞争性探针去间接捕获衣康酸靶点,并发现和验证了ALDOALDHA等关键糖酵解代谢酶,但是这种间接的方法只能运用于裂解液水平,因此,作者继续深入研究,通过设计衣康酸探针,开发了可以直接运用于活细胞水平的衣康酸靶标发现新方法。

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1. itaconate-alkyne (ITalk)探针的设计与评价。
作者首先针对衣康酸的结构设计化学探针,在保留活性基团的基础上,引入一个炔基,命名为ITalk。炔基的引入对衣康酸的活性没有影响,同时能够和代谢物形成有效的竞争。
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2. ITalk概括了itaconate的功能。
ITalk除了和衣康酸具有相似的半胱氨酸反应活性外,在LPS刺激的Raw264.7细胞模型中,ITalk可以显著抑制白介素IL-1β)的分泌,其药效与OI相似。另外,ITalk可以调节糖酵解通路中的代谢物利用,葡萄糖的消耗和乳酸的产生减少。因此,ITalk是衣康酸的功能类似物。同时,ITalk100uM12h标记条件下,在BMDMNeuronA549细胞系中均可实现活细胞标记,且无明显的细胞毒性。另外,作者在细胞中过表达衣康酸的3个已知靶标:KEAP1ALDOALDHA,并通过ITalk成功的捕获到这三个靶蛋白,说明通过ITalk可以实现细胞上直接发现衣康酸的未知靶点。
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3. 炎症巨噬细胞中itaconate修饰蛋白的化学蛋白质组学分析
作者在LPS刺激的巨噬细胞中,给予100uM ITalk探针12h,再通过基于CuAAC反应的化学蛋白质组学技术对衣康酸修饰靶点进行富集和检测,最后选择富集后丰度提高10倍以上,且至少有2个生物学重复的蛋白作为候选靶点,共计1926个。之前通过糖基化探针竞争半胱氨酸鉴定到的231个衣康酸靶点,有78%181)被ITalk探针捕获到,其中包括KEAP1ALDOALDHA。另外,作者对DDB1GSNACLYAK24种蛋白与ITalk进行了结合验证。
作者想进一步区分衣康酸靶标的活性。在细胞上用ITalk标记1h10h,再分别用甲基化进行轻重标,最终定量出1686个蛋白,其中199个蛋白为高反应活性靶点(即标记1h即达到饱和),这些蛋白主要聚集在转录和脂肪酸β氧化通路中
然后作者通过TOP-ABPP的方法进一步鉴定炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰位点,共鉴定出862个蛋白、1131个位点,且存在18个赖氨酸和8个组氨酸ITalk修饰。其中,多个与炎症应答和自身免疫防御相关的蛋白存在衣康酸修饰,这表明衣康酸通过多条通路调节巨噬细胞的功能。
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4. ITalk在炎性巨噬细胞中对衣康酸底物的位点特异性分析。
作者对上述通路中的衣康酸修饰位点进行了验证。BRI3BWIPI3位点突变后,ITalk无法标记,而RIPK33个修饰位点中,只有C360突变后会导致ITalk标记效率下降。RIPK3的激活与necrosis(一种程序性坏死过程)相关,通过激活MLKI启动。而衣康酸和OI可以促进RIPK3 S323位点和底物MLKI的磷酸化,C360位点突变后,衣康酸对RIPK3的调节作用消失,说明衣康酸通过C360位点激活RIPK3信号。
综上所述,作者在前期设计了S-糖基化竞争性探针,运用间接法大规模鉴定衣康酸靶点后,进一步拓展研究,设计了ITalk探针,可以直接捕获衣康酸修饰靶蛋白,并且实现了活细胞标记,加深了我们对衣康酸在巨噬细胞炎症中生理作用的理解,同时对探索衣康酸在其他疾病模型中的作用奠定了基础。
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b11962


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