分享一篇发表在JACS上的文章，文章题目是“Fluorescence-Based Detection of Fatty Acid β-Oxidation in Cells and Tissues Using Quinone Methide-Releasing Probes”通讯作者是日本九州大学的Akio Ojida。

细胞代谢作为基本的生物学过程，在维持生物体内平衡中起着核心作用。代谢途径一般由连续的多步反应组成，代谢通量主要由特定途径中涉及的各种酶的活性来调节。代谢通量是动态变化的，以应对外部或内部刺激，来维持能量生产和关键代谢物的最佳水平，而代谢通量的长期变化往往与疾病的发生有关。因此，检测代谢过程和代谢通量动态变化对于理解疾病的发生和发展至关重要，也有助于发现有价值的治疗目标，并促进药物开发用于治疗疾病。

基于质谱的代谢组学方法能够检测到不同代谢途径的细胞的代谢状态，提供了关于代谢物丰度信息，但却不能检测到代谢途径动力学的变化。基于质谱的代谢通量分析，采用稳定的同位素标记的底物（如13C标记的葡萄糖），这种方法可以根据标记代谢物的检测结果，定量评估给定代谢途径的通量。但这种代谢通量分析也存在一些缺点，如在复杂的生物样品中难以标记代谢物，需要特殊的统计分析来评估通量模型的准确性，以及需要昂贵的同位素内标来确定代谢物的绝对浓度。荧光分析是研究代谢途径通量的另一种可能的替代方法。与基于质谱的技术相比，使用功能优化探针的荧光分析可以促进敏感和选择性地观察代谢活性，而不需要特殊的检测技术和复杂的数据分析。尽管有这些优点，这种基于荧光的分析仍然很少。虽然单一代谢反应和代谢物的荧光探针已有报道，但这些探针不能对整个代谢途径进行通量分析。

脂肪酸β氧化(FAO)是脂质分解代谢的关键过程。FAO途径涉及通过一组四种酶促反应(图1a)将脂肪酸链反复降解为乙酰辅酶A(一种双碳酰基化合物)。中长链脂肪酸(C8-C18)主要在线粒体中分解代谢，而非常长链脂肪酸(超过C22)在过氧化物酶体中发生β氧化。FAO代谢异常与许多疾病状态有关，如癌症，糖尿病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。

基于以上问题，作者在之前的工作中开发了一种能够直接检测活细胞中FAO活性的荧光探针。探针结构中的脂肪酸单元能够被FAO逐步分解并最终释放7-羟基香豆素产生荧光信号(图1b)。由于香豆素荧光团发射波长短，荧光强度低，使得该探针在活细胞中的应用受到限制。作者在这项工作中介绍一种新的化学探针，可以检测活细胞中FAO的活性(图1c)。基于FAO触发的反应性醌甲基(QM)的形成，使得该探针能够使用不同的分析技术(包括荧光成像，基于活性的蛋白质分析(ABPP)和荧光激活细胞分选(FACS))检测细胞和小鼠肝组织中的FAO活性。此外，FACS和基因表达分析的结合揭示了肝细胞中FAO活性的代谢异质性，证明了该探针在基于荧光的FAO分析中的通用性。

首先，作者合成了QM释放探针1-3，通过稳定性和检测结果筛选出了探针3用于检测活细胞中的FAO活性(图2a)。在FAO抑制剂etomoxir预处理细胞时，代谢产物的峰值几乎消失(图2c)。探针1-3在活细胞中通过ABPP来检测FAO的结果显示，荧光带强度随孵育时间的增加而逐渐增加(图3a)，探针3标记蛋白的效率最高(图3b)。当用etomoxir预处理细胞后荧光带几乎消失(图3d)。这些结果都表明了探针3能够通过FAO降解形成活性QM并与细胞蛋白发生反应。

接下来，作者通过化学蛋白质组学分析了QM对细胞蛋白质的反应性(图4a)，共鉴定出883个蛋白质，包括参与FAO途径的几种线粒体酶。富集蛋白质的亚细胞分布于细胞质和/或核(62%)，线粒体(12%)和ER(6.3%)(图4b)。接着，作者评估了由3生成的QM在中性水条件下的稳定性(图4c)。TFA对9的酸性甲氧基(MOM)脱保护得到了作为QM前体的10。10在50 mM HEPES缓冲液中于310 nm处显示出较强的吸收(图4d)，随着256 nm处的吸收增加，310 nm处吸收随时间的变化逐渐减少，表明QM通过水解转化为苯酚11。310 nm处吸光度变化的一级反应动力学表明QM的半衰期为38.5 s(图4d-e)，明显长于文献中报道的典型的1,4-QM的半衰期(2.67 × 10−3 s)，表明探针3产生的QM反应性较低。作者推测，这种QM的低反应性阻止了它与线粒体蛋白的快速反应，并促进了它在细胞内的扩散。这是检测细胞中FAO的理想特性，因为QM不会干扰FAO酶的活性。

接下来，接下来作者利用荧光成像可视化FAO在细胞中的活性。在该实验中，将HepG2细胞与探针3在无血清DMEM中孵育20-60分钟，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用4%多聚甲醛固定，并与TAMRA叠氮化物进行CuAAC反应。共聚焦荧光显微镜结果显示细胞内TAMRA荧光信号随孵育时间的增加而增强（图5a）。成像结果显示荧光未定位于这些细胞内的任何特定区域（图5a）。这一观察结果与化学蛋白质组学分析的结果一致（图4b）。相反，当HepG2细胞用etomoxir预处理12小时，细胞内的荧光信号几乎没有任何增强（图5a）。用带有C4脂肪酸的探针8孵育细胞也没有荧光信号的增强（图5a）。这些对照实验的结果与凝胶成像分析的结果一致（图3d）。用探针3孵育A549和HeLa细胞，然后进行CuAAC反应也产生明亮的荧光信号（图5b）。作者在CuAAC反应中使用含有叠氮取代基的荧光素或Cy5代替TAMRA-叠氮化物，利用绿色和远红色波长通道可视化HepG2细胞中的FAO活性（图5c）。这些结果证明了探针在荧光成像中的多功能性。作者进一步合成了带有反式环辛烯基团的探针13，尝试通过四嗪连接检测FAO活性，这样就不需要固定细胞的操作（图5d）。HepG2细胞最初用探针13孵育，随后用BODIPY-tetrazine14处理。如图5d所示，在细胞内观察到明亮的荧光，而在用etomoxir预处理的细胞中荧光要弱得多。这表明QM与细胞内亲电试剂反应后是稳定的，不容易从细胞中释放。

FAO在肝脏脂质储存和消耗方面发挥着重要作用。FAO在肝脏中的异常活动与肝癌和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等疾病有关。因此，作者使用探针3检测小鼠肝脏中的FAO活性。小鼠腹膜注射探针3，并在1小时后处死以收集肝脏样品。然后用TAMRA-叠氮化物处理切片的肝脏切片并进行荧光成像。如图7a所示，在切片切片的整个区域观察到TAMRA的明亮荧光。放大的图像显示荧光位于肝细胞内部（图7b）。相反，在用探针1处理之前向小鼠施用etomoxir基本上抑制了荧光强度。带有C4脂肪酸的探针8也没有产生荧光信号。ABPP分析表明，用3处理后肝组织中生成QM，其通过预施用etomoxir有效抑制（图7c）。而用4时未检测到QM生成（图7c）。这些结果与从组织切片的荧光成像中获得的结果非常一致。

在这项研究中，作者开发了一种新的化学探针3，用于荧光检测细胞中的FAO活性。基于FAO触发的QM释放和共价锚定，然后与荧光团进行生物正交偶联，探针3能够在各种荧光分析中以多种波长通道检测细胞中的FAO活性。探针3在检测小鼠肝细胞中FAO活性的异质性方面进一步证明了其实用性。这是第一个在小鼠模型中检测FAO活性的探针。这种基于荧光的平台将进一步适用于与脂肪酸代谢相关的生化和生理学研究，作为对现有质谱技术的补充分析方法。探针3将通过结合单细胞组学分析，有助于了解FAO在单个细胞中的代谢异质性。最后，考虑到探针3的简单和模块化设计，可以重新利用目前的传感方法来分析其他代谢途径。

文章链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c02043.