分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.杂志发表题为ACR-Based Probe for the Quantitative Profiling of Histidine Reactivity in the Human Proteome的研究论文，文章的通讯作者为大连化物所叶明亮研究员。
在20种编码蛋白质的氨基酸中，His是一种有用的催化成分，在酶中占1/5以上的活性位点。为了证明His的反应性和翻译后修饰(PTMs)，先前的工作是使用碘甲烷对His的残基进行标记。此外，其他几种试剂包括生物激发的硫代磷酸二氯酯试剂被用于His标记。与Lys和Cys相比，His的咪唑侧链同时表现出较弱的亲核亲电性，导致残基反应活性较低。目前，经典abpp探针的His咪唑链与亲电试剂或亲核试剂之间仍难以形成稳定的键。这些反应大多需要苛刻的条件，例如极端的pH值和高含量的有机溶剂。
本文报道了在本研究中，我们发现α，β-不饱和醛在生理条件下能以稳定的Michael加成方式与His残基反应。此外，引入的醛可作为后续可逆富集的可富集标记物，为His的标记提供了理想的探针。
His残基在生理条件下的标记效率是其整体反应性分析的关键因素。为了探究使用该方法进行His标记的性能，首先研究了不同的α，β-不饱和醛探针的反应性(图1a)。在探针的初步筛选中，利用8种不同取代基的α，β-不饱和醛在PBS缓冲液中标记HeLa细胞裂解液中的蛋白质(图1b)。使用可逆联氨化学法进一步富集标记肽，并进行ms进一步分析。观察到，随着探针长度的增加，标记His残基的数量显著减少，在三个技术重复(A1, A2和A3)中，用三个探针标记并识别了300多个His残基(图1c)。因此，这三个探针被用于后续的实验。使用A1探针(丙烯醛，ACR)获得了平均1912个His残基，覆盖了其他结果中84%的His位点(图1d)。这可能是由于ACR的高活性和小尺寸，避免了蛋白质袋中的空间位阻。
图1 α，β-不饱和醛探针用于His残基反应性分析。为了避免Cys的干扰，本工作在标记步骤前进行烷基化反应。采用碘乙酰胺(IAA)、氯乙酰胺(CAA)、n -乙基马来酰亚胺(NEM)三种烷基化试剂对His进行了鉴定。如图2a所示，与对照样品相比，经IAA和NEM烷基化处理后，His残基的鉴定数量明显增加。基于phospors软件计算的高置信度，在三个技术重复中鉴定出多达4638个ACR标记的残基，其中近90%被分配为唯一修饰的His残基(图2c)。此外，如图2e，发现两个MDH成员的两个活性His位点(MDH1中的His187, MDH2中的His200)通过基于acr探针的方法被标记。因此，上述结果表明，ACR标记法结合NEM处理对His残留的标记和识别具有较高的覆盖率。图2 ACR和烷基化试剂对His残基的标记效率研究。接下来，ACR标记方法进一步用于His在人类蛋白质组中的反应性的全局定量分析。如图3a所示，HeLa细胞蛋白通过ARC标记方法进行质谱分析，总共对8222个His残基进行了明确定量(图3b)。两次重复实验的结果均覆盖了鉴定出的His残基的80%，表明His残基的标记和鉴定具有良好的重复性(图3f)。据观察，22%的蛋白质被鉴定出至少有4个His残基，证明了His残基表征的高覆盖率(图3c)。评估His残基在二级蛋白结构中的位置，根据Alphafold 2.0生成的结构，其中35.7%和14.4%的His残基位于α-helix和β-sheet结构中，49.9%的His残基位于loop区域(图3d)。对已鉴定蛋白根据His残基的活性区分，发现292个蛋白中有317个His残基表现出高反应性，占比<10%，其高反应率在0.5 ~ 2.0之间。此外，还获得了442个中等活性的His残基(图4a)。在292个鉴定出超反应残基的蛋白质中，90%的蛋白质在定量的多个His残基中只含有一个超反应残基(图4b)。还观察到只有22.9% (67/292)的超反应残基被包括在药物库数据库中。对未纳入DrugBank的225个蛋白质进行基因本体(GO)分析。其中近70%被注释为具有酶和基因表达功能，这与报道的药物靶点一致(图4c)。在鉴定的超反应基团蛋白中，果糖-二磷酸醛缩酶A (ALDOA)在糖酵解和糖异生中起关键作用。ALDOA四种His残基被覆盖，包括His21、His157、His246和His362，只有His362表现出高反应性 (图4f)。如图4h所示，MS/MS谱清晰地确定了His362的ACR标记。在低剂量ACR标记的消化样品中也得到了另外3个鉴定的残基，进一步证实了在复杂样品中标记的可信度。在使用PDB数据库进行的详细结构分析中，观察到Tyr364是1,6-二磷酸果糖(FBP)优于1-磷酸果糖的必要条件(图4e)。此外，对ALDOA的催化活性进行了测试，发现ACR处理(50 μM, 1 h)后，ALDOA的催化活性明显降低(图4g)。因此，这项工作可以为共价药物靶点的筛选提供更多的候选区域。综上所述，作者开发了一种基于ACR探针的策略，用于在蛋白质组水平上定量分析His反应性。在该策略中，利用ACR探针展示了生理条件下His残基的位点特异性标记，并结合可逆联氨化学富集。与经典的基于点击化学的ABPP方法相比，该策略引入了ACR作为反应基团和可富集标签。此外，在肽释放过程中引入了稳定的同位素标记，从而避免了昂贵、耗时的同位素连接剂制备步骤。总共有超过8200个His残基被明确确定，包括许多先前未在Lys和Cys数据库中覆盖的不可药蛋白。这些位点可能是破坏多种蛋白质活性的可配体残基。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c12653
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