分享的是一篇2022年发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目是”Chemiluminescent Probes with Long-Lasting High Brightness for In Vivo Imaging of Neutrophils”。文章的通讯作者是南洋理工大学的浦侃裔教授。作者报道了一种基于苯唑-苯氧基-二氧杂环丁烷（BAPD）的化学光素团，具有分子内氢键，用于中性粒细胞的体内成像。与经典相比，BAPDs在水溶液中的化学发光半衰期和亮度分别提高了约33倍和8.2倍。作者开发了基于BAPDs的化学发光探针用于腹膜炎和银屑病小鼠模型中中性粒细胞的实时成像。并且分子内氢键的设计也可以用于提高其他种类发色团在应用中的性能。

免疫细胞的成像对于了解其病理生理功能、探索其诊断和预后潜力以及癌症和自身免疫性疾病治疗的创新至关重要。作为先天免疫的成员，中性粒细胞通过产生多种细胞因子来操纵急性和慢性炎症中的宿主-病原体相互作用，从而引发即时反应。然而，中性粒细胞检测的临床方法依赖于组织活检或血液分析，这些方法是侵入性和静态的。虽然荧光探针为中性粒细胞的实时跟踪提供了一种非侵入性和动态的方法，但是荧光探针对实时光激发的要求会导致组织自发荧光和浅层组织穿透，限制了其体内成像应用。

化学发光成像消除了对光激发的需要，从而避免了组织背景信号，是一种比荧光更灵敏的体内成像方式。因此作者报道了具有氢键延长半衰期的超亮可活化化学发光探针的合成，用于中性粒细胞的体内成像。作者将苯并唑衍生物引入金刚烷基-1，2-二氧杂环丁烷支架中苯酚的邻位，诱导苯酚-二氧杂环丁烷中间体中分子内氢键的形成，从而延迟酚羟基中间体的去质子化（图1），最终延长化学发光。此外，由于苯并唑衍生物固有的高荧光QYs，因此合成的化学发光探针具有更好的光学性能。

图 1.化学发光BAPD底物的机理比较。

由于为了验证探针的化学发光机理，作者合成了三种对超氧物（O₂⁻）反应的模型探针（BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu）。这三种探针在没有O₂⁻的情况下观察到可忽略的化学发光和非常低的荧光，因为苯酚在金刚烷基-1，2-二氧杂环丁烷中的给电子能力在“笼状”状态下较低。在O₂⁻切割BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu的磺酸酯基团后，荧光信号增强40倍左右。这归因于具有激发态分子内质子转移（ESIPT）的苯甲酸酯的较高荧光强度。并且这些探针对其他ROS和金属离子的微弱化学发光证实了高选择性（图 2）。

为了证明BAPD中的分子内氢键导致化学发光延长，作者通过1H-NMR分析模型分子的分子内氢键（图 2）。作者添加DMSO-d6在CD3CN中进行滴定实验，因为DMSO-d6是破坏分子内相互作用的良好氢键受体。ABTPD中酚羟基的质子峰位于12.56 ppm，明显高于AMPD的9.37 ppm（图 2），因为氢键合具有良好的屏蔽效果。加入DMSO-d6后，ABTPD中酚羟基的质子峰仅移动≈0.17 ppm，这证明ABTPD具有很强的分子内氢键。因此，ABTPD创下了半衰期最长的新纪录≈23.2 h，归因于酚羟基的分子内氢键。

图 2.探针的发光性能以及长效发光机理证明

作者使用BTPDNe和MPDNe（经典化学发光探针）对脂多糖（LPS）诱导的腹膜炎模型中的中性粒细胞进行实时成像。LPS用于刺激小鼠腹膜炎，导致CASP4/11激活，释放细胞因子IL-1β，导致中性粒细胞聚集。探针处理后分钟，观察到BTPDNe注射小鼠的强烈化学发光信号，约为MPDNe注射小鼠的2.15倍（图 3）。即使在60 分钟之后，注射BTPDNe的小鼠仍可观察到化学发光信号，但MPDNe处理的小鼠不能观察到。因此，由于BTPDNe具有更高的亮度和更长的半衰期，因此它比经典的化学发光探针（MPDNe）更适合于中性粒细胞的实时纵向成像。