分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“Dual-Site Fluorescent Probe for Visualizing the Metabolism of Cys in Living Cells”。文章的通讯作者为山西大学的阴彩霞教授。半胱氨酸 (Cys) 是一种含巯基的小分子氨基酸，在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用。正常水平的 Cys (30–200 μM) 维持各种蛋白质和主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH) 的合成，并作为人体新陈代谢中硫化物的来源。然而，过量的 Cys 与类风湿性关节炎、帕金森病和阿尔茨海默病等疾病有关。另一方面，据报道缺乏 Cys 会导致生长缓慢、水肿、肝损伤、皮肤损伤和虚弱。因此，可视化 Cys 内源性稳态的代谢至关重要。本文中，作者结合乙醇香豆素和对苯二甲醛，开发了1（方案 1）作为设计的荧光探针，用于可视化半胱氨酸在活细胞中的代谢。方案1. (a) Cys 在哺乳动物细胞中的有氧代谢和(b) 用于 Cys 代谢可视化的双位点荧光探针的设计作者首先探究了探针1对 CYS和SO2的荧光响应，如图1a所示，1在上述系统中显示非荧光发射；然而，Cys的添加在 514 nm 处诱导了开启荧光发射，并以 130 倍的增强达到峰值。伴随着荧光的变化，紫外-可见光谱中的最大吸收峰从 475 nm 变为 450 nm（图 S1）。1对 Cys的时间依赖性荧光响应（图1b）在 514 nm 显示检测过程在 100 s 内达到平衡，因此后续的荧光数据均在添加分析物 2 分钟后测量。根据 IUPAC 定义，10 份空白溶液的相应检测限为 0.46 μM（图1c）。值得注意的是，添加NEM 可以有效地淬灭添加 Cys 的1系统的荧光发射，然后通过进一步添加 Cys 来恢复（图1d）。对于亚硫酸盐检测，将Na2SO3添加到 PBS/DMSO 中的探针1系统（1/1，v/v，pH 7.4）中，在 510 激发波长下，以 576 nm 为中心产生显着的荧光发射nm 并以 4 倍增强达到峰值（图 2a）。与上述Cys检测系统类似，探针1对Na2SO3的检测过程在50 s内达到平衡，表明荧光数据应测量1 min添加分析物后（图 2 b）。检出限1计算得出Na2SO3为 6.5 μM（图2c）。其他分析物，包括各种氨基酸，尤其是Cys、Hcy 和 GSH，以及生物阴离子，在这些条件下不会干扰亚硫酸盐检测（图2d）。图 1. (a)在 PBS/DMSO（1/1，v/v，pH 7.4）系统中添加 400 μM Cys 后20 μM 探针1的荧光响应。插图：在手持式紫外灯照射下相应的荧光颜色变化。(b) 20 μM 探针1和 400 μM Cys 系统在 514 nm 处的时间依赖性荧光发射。(c) 1的工作曲线，用于检测通过将各种浓度的 Cys (0–300 μM) 添加到 20 μM 探针1获得的 Cys 。(d) 添加 NEM (400 μM) 后1 (20 μM) 对 Cys (400 μM) 的可逆性研究。图 2. (a) 在 PBS/DMSO 中添加 400 μM Na2SO3后 20 μM 探针1的荧光响应（1/1，v/v，pH 7.4）。插图：在手持式紫外灯照射下相应的荧光颜色变化。(b) 20 μM 探针1和 400 μM Na2SO3系统在 576 nm 处的时间依赖性荧光发射。(c) 1检测Na2SO3的工作曲线，通过将不同浓度的 Na 2 SO 3 (0–150 μM) 添加到 20 μM 探针1中获得。(d) 探针1的荧光响应朝向 400 μM Cys、Hcy、GSH、Ala、Asn、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Met、Ser、Trp、Tyr、SH–、F–、Cl–、Br–、SO42–、 NO3–、HPO42–和 SO32–。随后，探究了探针对活细胞中硫醇和 SO2的荧光成像效果，使用 A549 细胞测量探针1在细胞成像中的应用。图 3a显示用1染色的硫醇清除 A549 细胞在绿色和橙色通道中均未表现出荧光发射。然而，直接用1染色的细胞在 4 分钟内在绿色通道中显示出明显的荧光发射（图 3 b）。此外，外源性 SO32–在硫醇清除的 A549 细胞中，在与1孵育4 分钟后，在橙色通道中表现出明显的荧光发射（图3c）。上述数据表明1具有细胞膜渗透性，可以通过两个发射通道在活 A549 细胞中以高选择性成像内源性硫醇和外源性SO32– 。快速信号输出进一步支持使用探针1在细胞中进行实时硫醇成像。随后深入探究了活细胞中 Cys 代谢的荧光成像。图 3. A549 细胞中内源性硫醇和外源性 SO32–的时间依赖性共聚焦图像。(a) A549 细胞用 1 mM NEM 预处理，然后用1 (10 μM) 孵育。(b) A549 细胞与1 (10 μM) 孵育。(c) A549 细胞用 1 mM NEM 预处理，然后用 200 μM Na2SO3孵育 20 分钟，并进一步用1 (10 μM) 孵育。综上所述，作者基于对 Cys 及其代谢物 SO2的双重识别位点的合理设计，开发了第一个用于 Cys 代谢可视化的荧光探针。该探针对 Cys 具有快速且可逆的荧光响应，这使得该探针能够在体外监测 NEM 和 H2O2诱导的 Cys 浓度变化。此外，该探针对硫醇和SO2具有高选择性，成功应用于外源性 Cys 和 SO2斑马鱼成像。细胞实验表明该探针可用于A549 细胞的氧化还原动态成像。重要的是，通过比例荧光响应，该探针可以可视化活 A549 细胞中 Cys 向 SO2的酶促转化，从而更深入地了解Cys 的生理过程。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6b12845
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