分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.杂志发表题为Antigen-Specific T Cell Detection via Photocatalytic Proximity Cell Labeling (PhoXCELL) 的研究论文，文章的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院陈鹏/樊新元教授。

细胞间通信(通过细胞细胞相互作用(CCIs)或分泌配体)的信息通常在单细胞水平的组织解离和/或分析时丢失，这对于理解细胞的空间组织或连接如何影响细胞功能和细胞分化至关重要。通过近距离标记对生物相互作用进行化学分析是一种有吸引力的检测、解剖和发现分子间或细胞间通信的方法。特别是，这些基于近距离的标记策略允许将短暂的相互作用事件原位转移为持久的标记信号(例如，生物素)，为后续的表征(如单细胞分析)铺平了道路。

虽然近距离标记策略已被开发用于捕获生活环境中的T细胞免疫细胞相互作用，但目前的方法在很大程度上受到复杂的酶缀合物合成或小鼠基因工程的限制。此外，缺乏时空控制进一步使得这些方法难以准确地捕捉原始组织样本中瞬时或特定的T细胞相互作用。另一方面，大多数方法都不能通过独特的分子特征准确、完整地分离邻近细胞。为了满足抗原特异性T细胞时空定量检测的迫切需求，开发具有上述远程和时间控制能力的光催化平台是非常需要的。

本文报道了一种用于抗原特异性T细胞检测的光催化近距离细胞标记(PhoXCELL)策略，该策略为抗原特异性T细胞检测提供了一种非酶促的、单线态氧介导的近距离标记方法。选择二溴荧光素(DBF)作为有机光催化剂，在温和的条件下(520nm辐照)高效地触发相互作用细胞之间的近距离标记。通过优化的脂肪胺探针，光控单线态氧生成和随后的生物素标记进一步使细胞细胞相互作用的标记具有高空间精度。通过在T细胞免疫细胞突触内进行时空分辨的相互作用细胞标记，为从原代组织样本中快速检测肿瘤抗原特异性T细胞提供了一种有价值的方法。

首先，基于之前开发的酶介导N-端甘氨酸标记系统， DBF-LPETGG成功导入细胞表面， (图1a)。荧光成像和流式细胞术(FC)分析清楚地显示DBF有效地偶联在细胞表面(图1b)。接下来，系统地优化了DBF标记细胞表面的光催化标记反应，我们选择了三种波长的光来测试各种亲核性生物素探针在光氧化后的标记能力，包括伯脂肪胺、醇、硫醇、芳酚、苯胺、萘胺(图1c)。生物素-NH₂探针和520 nm波长被选为基于接近性的细胞表面标记的最佳条件。此外，进一步优化了生物素-NH₂的浓度和辐照时间，其中100 μM生物素-NH₂在10 min内产生饱和标记信号。在此优化条件下，通过共聚焦成像对DBF的光催化近距离标记进行了表征，证明了所期望的空间分辨率，在细胞膜上有清晰的标记信号(图1g)。

在验证DBF是一种可靠的细胞表面标记光催化剂后，使用抗原特异性树突状细胞和OT-I T细胞之间的相互作用作为模型来表征这种用于细胞间标记的光催化系统。利用一种转基因OT-I TCR，可特异性识别DC上的ovalbumin (OVA)257 264表位(SIINFEKL)呈递的MHC-I，可形成稳定的DC T细胞相互作用突触，该模型主要受已知分子对(TCR -肽MHC相互作用)的控制，可以通过外源添加的肽轻松调节，并且该模型在免疫学中已被很好地表征，并且可用于定量分析的补充分析。为了在该模型中演示PhoXCELL，在SIINFEKL肽启动后，DBF修饰的未成熟DC (iDCs)与OT-I T细胞共培养，然后在光照下进行PhoXCELL介导的生物素化(图2a)。流式细胞术分析显示，猎物OT-I T细胞(43%)上可以特异性且有效地检测到生物素信号，而无关的抗原引物或未引物的iDCs仅能诱导背景标记(1 4%)(图2b,c)。与此同时，早期T细胞活化标记物CD69在与抗原特异性dc相互作用后1小时内迅速上调。如图2b所示，CD69+激活的OT-I T细胞被选择性标记，验证了PhoXCELL通过DC T细胞相互作用捕获抗原特异性T细胞的特异性。脉冲追赶法证明了单线态氧诱导的细胞标记可以通过光照射快速打开/关闭(图2d)。为了检查相互作用细胞上的标记区，在PhoXCELL后对离体DC T细胞簇进行了共聚焦成像实验，并在相互作用突触中观察到显著的生物素信号(图2e)。总之，PhoXCELL诱导的细胞间标记由于其适当的扩散半径而在免疫突触中提供了精确的空间控制，并且可以通过面部开关进行时间控制标记。

PhoXCELL的时空控制能力促使我们进一步研究PhoXCELL是否能够区分DC T细胞相互作用的强度。我们建立了一个包括改变肽配体(APLs)的系统来调节OT-I T细胞和i DC之间相互作用的强度(图3a)。用不同浓度的APLs引物DBF-iDCs作为诱饵细胞，并利用PhoXCELL评估其与OT-I T细胞的相互作用能力。当APL浓度从100降低到1和0.1 nM时，接近标记信号随着CD69的趋势而降低，低亲和肽诱导低标记率和低CD69表达(图3b d)。为了进一步研究与不同强度的iDCs相互作用的OT-I T细胞的表型和功能特征，我们通过bulk RNA-seq鉴定了由N4引物(N4 Bio+)和V4引物(V4 Bio+) DBF-iDCs标记的Bio+亚群的转录谱(图3e)。火山图显示，N4 Bio+组有215个转录本显著上调，而有228个转录本下调(图3f,g)。基因本体(GO)富集分析显示，共有215个上调基因富集在细胞分化、细胞通讯、细胞粘附等生物过程中，这些上调基因与细胞因子活性等分子功能的富集与显性抗原特异性T细胞激活表型高度相关(图3h)。此外，京都基因与基因组百科(KEGG)分析显示，N4 Bio+中上调的基因富集在细胞粘附、细胞连接、氨基酸和脂肪酸代谢等途径(图3i)。总之，以上实验证明PhoXCELL是在复杂环境中捕获抗原特异性T细胞的强大工具，并可能使原代组织样本中抗原特异性T细胞的检测成为可能。

接下来，将收获的皮下实体肿瘤消化成单细胞悬液，通过密度梯度离心分离后，从肿瘤细胞中富集肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。来自肿瘤裂解物的TSA被用来启动作为诱饵细胞的自体iDCs。通过酶解和表达DCs，非突变多肽和TSA相关表位被加载到iDC表面的MHC上。值得注意的是，当共培养时，引物的iDCs可以识别TSA反应性T细胞并与之相互作用，这促使我们假设TSA反应性T细胞可能通过我们基于phoxcell的抗原特异性T细胞捕获策略被生物素标记和富集(图4a)。为了验证这一假设，选择小鼠E0771三阴性乳腺癌(TNBC)样本作为模型。TSA引物的DBF-iDCs不仅捕获了自体CD8+ TILs(35.9%)，而且同时检测了CD4+ TILs，标记率相似(29.1%)(图4b,c)。此外，我们在引流淋巴结(DLN)中进行了TSA反应性T细胞捕获。PhoXCELL检测到dLNs中CD8+和CD4+ tsa反应性T细胞的比例较低(CD8+ T细胞为4%，CD4+ T细胞为14.2%，图4b,d)，表明存在较少且亲和力较低的TSA反应性T细胞。这证明了PhoXCELL在离体捕获抗原特异性T细胞方面的鲁棒性。

综上所述，本文报告了一种通过光催化近距离细胞标记(PhoXCELL)检测和定量细胞相互作用的时空分辨方法。利用和优化了生物相容性光敏剂二溴荧光素(DBF)作为酶促方法的非遗传替代方案，在细胞表面进行光照射(520 nm)时有效生成单线态氧，从而允许后续使用基于脂肪族胺的探针标记附近的氧化蛋白。DBF功能化的树突状细胞(DCs)可以通过定量区分相互作用强度的快速光照射在免疫突触中时空标记相互作用的T细胞，同时，该方法可以检测小鼠肿瘤模型中肿瘤浸润淋巴细胞和引流淋巴结中的肿瘤抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，使PhoXCELL成为一个强大的平台，可以在T细胞受体(TCR)相关的个人免疫治疗中识别抗原特异性T细胞。