分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目为“Photostable Small-Molecule NIR-II Fluorescent Scaffolds that Cross the Blood-Brain Barrier for Noninvasive Brain Imaging”。文章的通讯作者为美国莱斯大学肖汉教授与上海药物研究所程震教授。荧光成像技术具有高时空分辨率、无损显现和灵敏度高等特点，被广泛应用于生物医学成像等领域。近红外二区(1000-1700 nm, NIR-II)荧光成像与可见光和近红外一区荧光成像相比，具有更低的组织自发荧光、更深的组织穿透深度和更高的成像分辨率等优势，被认为是一种极具潜力的诊疗成像方式。血脑屏障（BBB）是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，仅允许特定类型的分子从血流进入大脑神经元和其他周围细胞，严格调节血液和大脑之间的物质运输。血脑屏障的存在阻碍了小分子探针进入大脑，因此，作者基于BF2甲臜类化合物，通过引入不同取代基控制分子的发射波长及其亲脂性，开发了一种能够穿透血脑屏障的NIR-II荧光小分子探针，从而实现对脑组织成像及对脑部疾病的诊断。首先作者基于BF2甲臜类化合物，引入不同取代基，设计了一系列NIR-II荧光小分子(图1a)。由于高度离域的π-体系和低阶前线轨道，它们具有丰富的光物理性质。由于相对较小的体积、适宜的亲脂性、低极性表面积和低电荷，它们具有潜在的穿透血脑屏障的能力。理论计算也表明HOMO和LUMO的电子云主要分布在BF2骨架上，其余分布在N的1,3-号位上的π-共轭芳香环(图 1b)。接下来，作者测试了染料在有机溶剂和生物基质中的光物理性质，BF1−BF8染料在DMSO中的近红外吸收峰为727 ~ 859 nm，随着取代基的变化，这些染料逐渐红移(图 1c)，在DMSO和FBS中，所有染料的荧光光谱都有800 ~ 1400nm的宽发射波段(图 1d)。采用不同的长通滤光片对染料发光进行过滤后，如图1e所示，大多数染料在1000nm以上表现出强烈的荧光，与其他报道的NIR-II荧光团相比，BF1−BF8小分子染料具有更高的量子产率，BF1−BF8光谱表现出较大的斯托克斯位移，特别是BF1在DMSO和FBS中分别有230 nm和198 nm的斯托克斯位移(图1f)。作者研究了染料在去离子水(DI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和FBS中的NIR-II荧光发射，结果表明所有染料在DI和PBS中均有荧光猝灭，而FBS在1000nm以上仍有较强的荧光信号(图1g)。最后，通过监测DMSO和FBS中的荧光强度，评价了这些染料和ICG的光稳定性。与ICG的快速降解相比，所有染料都表现出良好的发射稳定性(图1h)。如图1i所示，在活性氧(ROS)存在和较高的pH值条件下，染料也具有良好的化学稳定性。这些数据证实了BF1−BF8小分子染料具有体内成像的潜力。图1.(a)BF1−BF8的结构。(b)计算BF1的HOMOs and LUMOs。(c) BF1−BF8在DMSO中的归一化吸收光谱。(d) BF1−BF8 在DMSO中的归一化荧光光谱。(e)长通滤波器收集的BF1−BF8彩色图像。(f) BF1在DMSO和FBS中的斯托克斯位移。(g) BF1 )在去离子水(DI)、PBS缓冲液和FBS中的NIR-II荧光图像。(h) FBS和DMSO中BF1和ICG的光稳定性曲线。(i) BF1 在不同pH和ROS存在下的PBS缓冲液中的荧光稳定性。在进行体内NIR-II成像之前，作者首先进行了细胞内NIR-II成像测试。将U-87MG细胞分别与BF1-BF8染料进行共培养。细胞图像显示，所有染料在细胞环境中都具有良好的细胞穿透性和明亮的NIR-II荧光(图2a)。作者进一步测试了BF1−BF8染料在细胞内的光稳定性，染料表现出良好的胞内光稳定性。在高激光功率密度下照射10 min时，观察到BF2甲臜类化合物染料的荧光没有明显下降，而在相同条件下，ICG的细胞内荧光在12 s内急剧下降(图2b,c)。这些数据证实了BF1−BF8小分子染料适用于体内成像。为了进一步评价BF2甲臜类化合物染料穿越血脑屏障的能力，作者构建了体外血脑屏障模型(图2d)，稳定的跨内皮电阻(TEER)值证实血脑屏障层成功建立。将BF1−BF8和EB分别加入上腔，测定不同时间点(30、60、90、120 min)下腔的染料吸光度值。2小时内BF1和BF6在下腔中达到较大的浓度，表现出更高的血脑屏障渗透能力。BF2−BF5、BF7、BF8和EB在下腔中增加缓慢，表明这些染料的血脑屏障渗透率较低(图2e)。为了研究染料的成像性能，选择BF1和BF6在模拟组织中进行散射和穿透实验。即使模拟组织深度为5mm，也能清楚地观察到两种染料的荧光信号(图2f−i)。图2.(a) U-87 MG细胞中BF1−BF8的荧光成像。(b)激光照射下U-87 MG细胞在0、4、8和12 s时ICG和BF1的荧光成像。(c) ICG和BF1在25 s内的细胞光稳定性曲线。(d)体外血脑屏障模型示意图。(e)体外2 h内BF1−BF8和EB的相对扩散量。(f)模拟BF1和BF6在组织中0 ~ 6 mm处的荧光图像。(g, h) (f)中沿红色虚线的BF1和BF6在不同组织深度的截面荧光强度分布图。(i)BF1和BF6的信噪比(SBR)曲线。鉴于BF2甲臜类化合物染料良好的光学性质以及在模拟组织中优越的血脑屏障穿透能力，为了评估染料用于NIR-II脑组织成像的使用，作者将BF1−BF8染料使用尾静脉注射小鼠，然后在体内进行NIR-II荧光成像。如图3a,c所示，注射小鼠活体后，在脑组织中观察到明显的BF1和BF6的荧光信号，荧光强度分别在注射后20和45 min达到最大值，获得了2.5- 2.9高信噪比的清晰大脑图像(图3b,d)。相比之下，注射BF2、BF3、BF4、BF5、BF7、BF8的脑组织未观察到明显的NIR-II信号。如图3e,f所示，经ICG处理的小鼠仅在大脑血管中显示出荧光信号，随着时间的延长，信号逐渐消失(图3e,f)。注射后2 h，分离脑、心、肺、肾、脾、肝、肠、胃、骨、肌肉和胰腺等多个器官，用于离体NIR-II成像。体外荧光图像显示BF1和BF6在脑组织中大量积累(图3g,h)。为了进一步确认BF1和BF6的血脑屏障穿透能力，对注射了这些染料的小鼠脑匀浆进行质谱分析(图3i,j)，高效液相色谱(HPLC)分析显示，与标准曲线相比，注射后BF1和BF6在脑组织中积累(图3k)，证实了BF1和BF6具有较高的血脑屏障渗透性。由于BF6的信噪比较高，因此选择BF6作为进一步研究的对象。接下来，作者研究了染料在血脑屏障中的扩散过程。在成像之前，在麻醉下通过手术打开小鼠头皮，以避免头皮血管的干扰。注射后90 s内，在808 nm激光刺激下，脑血管比脑组织有更明亮的荧光(图3l)。随着BF6从颅内血管扩散到脑组织，整个大脑被照亮。定量荧光数据显示，组织与血管之间的NIR-II荧光比值在160 s内逐渐升高(图3m,n)，脑组织的荧光强度在100秒内超过了颅内血管，表明BF6在体内可快速渗透血脑屏障。相比之下，在ICG注射的小鼠中，NIR-II信号被限制在血管内，随着时间的推移，没有观察到向脑组织的额外扩散(图3l,o,p)，这意味着ICG染料无法穿过血脑屏障。
图3.(a)尾静脉注射BF1的小鼠脑组织活体NIR-II荧光成像。(b)注射BF1小鼠的信噪比变化。(c)尾静脉注射BF6小鼠脑组织的活体NIR-II荧光成像。(d)注射BF6小鼠的信噪比变化。(e)尾静脉注射ICG小鼠脑组织的活体NIR-II荧光成像(f)脑组织荧光强度随时间的变化。(g, h)注射BF1和BF6后2 h不同器官的荧光图像。(i, j)静脉注射BF1和BF6 1 h后提取的小鼠脑组织质谱。(k) BF1和BF6染料和BF1和BF6处理小鼠反应脑匀浆的HPLC。(l)静脉注射BF6和ICG后不同时间点的活体脑血管组织NIR-II荧光成像变化。(m) (l)中BF6静脉注射后不同时间点脑组织和血管荧光比的变化。(n)静脉注射BF6后，在指定时间点沿(l)中红色虚线采集的横切面荧光强度分布图。(o) (l)中静脉注射ICG后不同时间点脑组织和血管荧光比值的变化。(p)静脉注射ICG后，在指定时间点沿(l)中红色虚线采集的横切面荧光强度分布图。最后，作者分别将BF1、BF6和ICG注射到患有脑胶质瘤(GBM)的小鼠体内。根据先前报道的方案，将U-87 MG GBM细胞引入小鼠大脑，在肿瘤植入后3 ~ 4周，将ICG溶液静脉注射到小鼠体内，使用NIR-II荧光对完整大脑进行无创成像。24 h后，用BF1或BF6对同一小鼠进行处理，随后再次进行无创成像。由于ICG在活体小鼠体内代谢快，作者在120 s内采集了6个时间点的荧光脑图像，而BF1和BF6处理后在60 min内采集图像。如图4a,b所示，ICG照亮了脑血管，这表明小鼠大脑中存在胶质瘤。120 s内，ICG荧光信号在血管内始终受限，并逐渐消失。研究证实，在存在胶质瘤的情况下，血脑屏障可以防止ICG渗入脑组织。注射BF1和BF6后 60 min内部分脑组织荧光强度升高(图4a,b)。ICG与BF1、BF6切面荧光强度分布有显著差异，反映了两者不同的成像方式(图4c,d)。大脑的正常组织比脑胶质瘤组织区域有更强的荧光信号，这表明染料在正常的大脑组织比在胶质瘤区域更容易聚集。离体成像与体内成像结果相似，正常脑组织比脑胶质瘤组织表现出更高的荧光强度，因此可以很容易区分脑胶质瘤组织和正常脑组织。图4.(a) ICG和BF1尾静脉注射后小鼠脑胶质瘤区域白光成像和NIR-II荧光成像。(b) ICG和BF6尾静脉注射后小鼠脑胶质瘤区域白光成像和NIR-II荧光成像。(c, d)通过1000nm长通滤波器采集(a)和(b)中沿白虚线的横截面荧光强度分布图。综上所述，作者基于BF2甲臜类化合物开发了一系列具有高稳定性、大斯托克斯位移、高亮度的能够穿透血脑屏障的NIR-II荧光团。在小鼠脑胶质瘤模型中，还可用于区分脑胶质瘤区域和正常组织，为用于脑成像和诊疗的NIR-II小分子探针的设计提供了一种有潜力的分子支架。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c11223
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