为大家分享一篇发表在ACS Chemical Neuroscience上的文章“Facile Installation of Post-translational Modifications on the Tau Protein via Chemical Mutagenesis”。本文的通讯作者是剑桥大学的Michele Vendruscolo和Gonçalo J. L. Bernardes教授。Vendruscolo组研究兴趣包括了解阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的分子起源，并以此为药物开发提供新的机会，以预防、延迟或治疗这些疾病。Bernardes组主要研究兴趣是设计化学反应对蛋白质进行精确的修改、修饰。
蛋白质翻译后修饰在生物体中普遍存在，因为它们可以精确地控制这些大分子之间的相互作用。一些神经退行性疾病（如蛋白病tauopathies和阿尔茨海默病AD等）以微管相关蛋白异常聚集物的积累作为特征，这些聚集物通常以高度有序的成对螺旋丝或神经纤维缠结的形式出现，在那里tau蛋白被严重磷酸化，或者产生其他翻译后修饰。Tau主要起到稳定微管的作用。到目前为止，tau磷酸化是研究最多的PTM，因为它是病理性tau聚集物中的主要PTM，也是蛋白质上最常见的PTM，其中超过一半的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基显示发生磷酸化。对于机制研究，能够在体外产生具有位点特异性的翻译后修饰蛋白将是非常有利的。为了探索Tau上磷酸化的功能，激酶的体外磷酸化以及使用天冬氨酸或谷氨酸的拟磷酸化突变已被广泛使用。然而，这些方法要么产生额外的磷酸化产物，要么产生部分满足磷酸化位置要求的产物。在这里，作者演示了一种通过使用翻译后化学诱变来实现这一目标的简便方法，并通过对tau进行位点特异性的磷酸化和甲基化来阐明这种方法。
在这项工作中，作者使用合成通用非典型氨基酸脱氢丙氨酸(Dha)作为获取精确PTM模拟物的媒介。为了方便Dha的安装，在靶位点引入半胱氨酸突变体前体，而两个天然的tau半胱氨酸也必须突变为丝氨酸，这已经被证明对tau聚合活性没有影响。首先，在目标位点引入Cys突变，之后利用2,5-二溴戊酸甲酯(MDBP)的双烷基化消除策略引入Dha。接着，由硫醇-Michael试剂在Dha上安装需要的修饰。然后，作者验证这些修饰过的tau变体的生理相关性，使用微管蛋白聚合分析确认，当通过上述半合成方法和体外磷酸化创建时，它们重现了观察到的类似活性。作者选择了三个位点和两个不同的PTMs进行研究，分别是脯氨酸富集区域(proline-rich domain, PRD)S199的磷酸化、微管结合区域(MBD)R4部分S356的磷酸化及R3部分K311的二甲基化。S199位点的磷酸化已经被确定为tau病理的早期标记物，但还没有功能特征。然后，作者验证了翻译后修饰对tau控制微管聚合能力的影响，特别揭示了S199位点磷酸化的意想不到的作用，该位点位于tau微管结合区域之外。S199位点的磷酸化可能调节PRD在微管关联中的作用，并可能解释其病理关联。
综上所述，本文描述了一种通过化学诱变对tau进行位点特异性翻译后修饰的方法，该方法使系统地分析参与阿尔茨海默病发病机制的关键蛋白的位点特异性翻译后修饰成为可能。
本文作者：WQW
责任编辑：LDY
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschemneuro.0c00761
原文引用：DOI：10.1021/acschemneuro.0c00761
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