作为生物体基本的结构和功能单位，细胞就像微观世界里的一个小国家。在这个“国家”中，众多结构各异的细胞器如同复杂多样的地形地貌，它们与细胞质等共同形成了多种独特的“自然景观”，“滋养”着丰富多样的生物分子。细胞内源性生物分子是一切生命活动的基础，直接可视化其结构特征和动力学行为对于理解各种生物过程中的分子机制具有重要意义。单分子定位显微镜(SMLM)能够打破光学衍射极限，在纳米级尺度上解析活细胞内的细微结构和生物过程。SMLM成像探针如同地貌探测工具，能够从复杂的细胞环境中提取到想要的细节。然而，传统SMLM成像探针尺寸较大，不利于SMLM对细胞内的精细结构和密集分布的生物分子进行精确定位。近几年来，凭借小尺寸和高特异性等优势，核酸探针已成为代替传统成像探针的有力工具。此外，基于其可编程特性，核酸探针可以通过序列设计形成多种构象，使其能更好地适应于细胞内多种微观“地貌”，进一步扩展了SMLM的生物分析应用。

近日，湖南大学袁荃教授和谈洁副教授在Chemical & Biomedical Imaging上发表了题为“Nucleic Acid Probes for Single-Molecule Localization Imaging of Cellular Biomolecular”的综述。本综述讨论了不同构象核酸探针用于单分子定位显微技术(SMLM)的设计思路，并总结了基于核酸探针的SMLM在生物分子领域的应用。最后，还对基于核酸探针的SMLM技术进行了总结与展望，旨在为获取细胞生物过程的纳米级信息提供指导。

文章首先介绍了SMLM的工作机制以及目前常见的三种SMLM技术，分别是：光激活定位显微技术(Photoactivated Localization Microscopy, PALM)，随机光学重建显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM) 和基于DNA的、用于纳米级拓扑结构成像的点累积成像系统 (DNA-Based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, DNA-PAINT)。其次，本文对用于SMLM的不同构象的核酸探针进行性能评价，包括：线性、发夹型、多面体核酸探针。研究人员通过序列设计构建多种构象的核酸探针，可以调控探针荧光信号的强度和闪烁时间等，从而进一步扩展核酸探针在SMLM成像领域中的应用。最后，文章总结了基于核酸探针的SMLM应用。其应用主要包括两方面：探索细胞内生物分子的空间分布，检测细胞内分子间相互作用。

基于核酸探针的SMLM成像技术不仅为解析细胞内细微的生物分子提供了新的工具，而且为研究复杂的细胞行为开辟了新的方法。但基于核酸探针的SMLM成像技术在未来的进一步发展也面临着一些挑战：首先，虽然SMLM是现有超分辨显微成像中空间分辨率最高的成像技术，但是SMLM成像过程中图像采集和定位重建非常耗时，无法同时满足时间和空间分辨率。第二，对细胞内生物分子进行单分子成像时，核酸探针需要具备穿透细胞膜以及亚细胞结构膜的能力。这对于探针的尺寸和特异性提出了更高的要求，增加了探针多样性设计的限制。第三，目前SMLM技术成像深度有限，难以对厚样品进行超分辨成像。第四，目前核酸探针主要应用于STORM和DNA-PAINT技术，用于PALM的却少之又少，还有待继续发展。