介绍一篇来自“Chemical Science”的文章，题名为“N-Methyl deuterated rhodamines for protein labelling in sensitive fluorescence microscopy”。

罗丹明荧光团是荧光显微镜的基准。在此，作者报告了四甲基（硅）罗丹明的氘 (d12) 同系物，通过四个甲基的同位素标记获得，显示出改进的光物理参数（即亮度、寿命）和减少的化学漂白。作者探索了活细胞中 SNAP 标签和 Halo 标签标记的这一发现，并强调了几个应用中的增强特性，例如荧光激活细胞分选、荧光寿命显微镜、受激发射耗尽纳米显微镜和单分子 Förster 共振能量转移。作者最终将这个想法扩展到其他染料家族，并将氘代设想为一个可推广的概念，以改进现有的和开发新的化学生物学探针。

作者通过设计、合成和测试羧基-6-四甲基罗丹明填补了同位素标记的空白，其中每个CH₃基团都被CD₃取代（图1A）。比较氘代和常规罗丹明，作者发现一些光物理特性保持不变，而其他的确实发生了显着变化，例如消光系数和绝对量子产率导致亮度增强(图1A)。作者在缓冲液中使用 TMR(d12)，并对样品进行强白光照射，并记录不同时间点后的荧光输出。结果突出表明，即使是细微的化学变化也会对光谱特性产生显着影响，从而朝着新的方向探索化学空间。

图1

接下来，作者转向在细胞外或细胞内表达的靶点上在活细胞中进行 SNAP 标记和成像，以确定它们的标记和渗透特性。作者使用稳定表达 SNAP 标记的胰高血糖素样肽1受体 (SNAP-GLP1R:CHO-K1) 的 CHO-K1 细胞。细胞用BG-TMR/SiR(-d12) 标记30min，结果显示 SNAP-GLP1R 染色与所有测试的氘代和亲本染料（图2A）。其次，在外部质膜上建立标记后，作者研究了在线粒体内膜中稳定表达 SNAP 标记的 Cox8A (SNAP-Cox8A:HeLa) 的活 HeLa 细胞的细胞内染色（图2B）。发现d12衍生物的亮度都有可观察到的增加。然后，作者用 BG-TMR(-d12) 和 BG-SiR(-d12) 标记 SNAP-GLP1R:CHO-K1 和 SNAP-Cox8A:HeLa 细胞，以通过后续分选比较红色和远红色的颜色强度（图2C）。当染料被氘化时，标记的 SNAP-GLP1R:CHO-K1 细胞的直方图显示荧光强度右移（图2C）。通过归一化强度和比较，作者计算出氘代染料版本的更高平均强度（图 2D）。这些结果表明，带有 CD₃胺的罗丹明不仅适用于活细胞成像，而且优于非氘代荧光团，这与未结合染料的体外数据一致。有了这些结果，作者决定在STED显微镜下测试氘化探针，这是一种揭示细胞动力学和结构的最先进的成像技术。结果显示氘化 d12 硅罗丹明在纳米级实验中显示出增强的亮度，同时保持分辨率。

图2

smFRET已成为研究生物大分子（动态）构象变化和异质性的行之有效的方法。作者测试了特异性附着在蛋白质半胱氨酸残基上的氘化荧光团是否可以获得更高的计数率。测试系统是 SBD2，SBD2 变体有两个标记位点 (T369C–S451C)，它们用染料组合TMR-d12–SiRd12（图3B）及其非氘代形式TMR–SiR以及作为对照的Cy3B-ATTO647N随机标记。对于所有染料组合，作者实现了每种染料的平均标记率40-90%。研究发现，与之前结果一致, 氘化导致 TMR-d12-SiR-d12 的计数率高于 TMR-SiR。总之，smFRET 研究结果表明，罗丹明的氘化是一种简单的解决方案，可以通过提高计数率来提高基于溶液的实验中的空间和时间分辨率。TMR-SiR（氘代和非氘代形式）不需要在成像缓冲液中添加光稳定剂来获得高质量的 E-S 直方图。

图3

最后，作者很想找到关于氘掺入如何改善荧光罗丹明的一些机制见解。首先，作者通过瞬态吸收光谱确定了 TMR(-d12) 和 SiR(-d12) 的激发态寿命，这与通过荧光寿命成像获得的寿命一致（图4A-D）。这表明发光状态的衰减与电子基态的恢复相关。特别是，发射态的衰减不会产生长寿命的三重态，这会出现在长寿命的瞬态吸收特征中。如果甲基的氘化影响旋转运动，将能够观察到温度升高时寿命的较小变化。为此，作者通过 FLIM以依赖于温度的方式获得了与 Tubb5-SNAP 和 Tubb5-Halo-标签（图 E ）结合的 SiR 和 SiR-d12 的荧光寿命。作者认为，由于氘的更强和更重的性质，通过围绕二甲基氨基的旋转而激发的单线态的非辐射衰变受到抑制（图4F）。

图4

总之，在此研究中，作者在一组应用中合成并测试了具有增强荧光特性的氘代荧光团。过去已通过使用氘化溶剂解决了使用氘来改善荧光发射特性的问题。在这项工作中，作者安装了用于 SNAP 和 Halo 标签共轭的标记部分，并将它们应用于不同的实验设置。这导致发现的 TMR-d12 和 SiR-d12 通过交换甲基上的氢和氘来改进，提高光物理参数，如亮度和寿命，同时减少关键化学参数。

本文作者：QHJ

责任编辑：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1039/D1SC06466E

DOI: 10.1039/d1sc06466e