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给大家介绍一篇来自“Developing Isoxazole as a Native Photo-Cross-Linker for Photoaffinity Labeling and Chemoproteomics “在这篇文章中,该课题组报告了异恶唑与生物分子的光化学,并将其开发为一种天然嵌入的光交联剂,用于化学蛋白质组学和药物发现。通过这种策略,两种含异恶唑的药物成功应用于化学蛋白质组学平台,以揭示它们的细胞靶点和相互作用。
迄今为止,由于具有独特的光化学特性,芳基叠氮化物、二苯甲酮和二氮杂环丙烷是三种主要的光交联剂。尽管它们得到广泛应用,但这些光交联剂仍然存在一个主要问题:当引入非天然光交联剂时,药物/配体的生物活性通常会减弱。开发原生嵌入的光交联剂可以有效解决这个问题。因此在这项研究中,他们报道了将一种常见的药效团异恶唑开发成一种用于化学蛋白质组学的新型光交联剂。
深入研究了异恶唑与氨基酸/肽/蛋白质的光反应。为了验证异恶唑的光反应,他们使用一种简单的异恶唑,即 5-苯基异恶唑-3-甲酸甲酯 ( MPISC ) 作为模型分子。首先测量了MPISC的紫外吸收,并观察到宽吸收(260-310 nm)。氮丙啶可以通过具有相对较低活化能势垒的过渡态与乙酸反应。随后,生成的氮丙啶具有低自由能,表明光交联产物的交联过程平稳且稳定性高。同时,氮丙啶中间体与胺/硫醇的 DFT 计算也证明了能量上有利的反应。MPISC在 5 分钟内与 Z-Glu-OMe 或乙酸迅速反应,并以高产率生产 氮丙啶产物(AZD1和AZD2 )。试了MPISC与含有不同残基的游离肽 (RQYAWESGFTCNHK) 的光反应。之后通过 MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析检测到具有 1 和 2 MPISC 修饰的肽。谷氨酸、半胱氨酸和末端赖氨酸被确定为确切的光交联位点,并且总共有 126 个残基被确定为特定的光交联位点。接下来,设计了一系列功能化的异恶唑探针 ( isx1 – 8 ) 用于体外/原位蛋白质标记。这些探针在异恶唑的五元环上装饰有不同的取代基,同时末端炔烃被引入到每个探针中,并作为蛋白质可视化和富集的双正交标签。他们在每条泳道中观察到约 70 kDa 的强荧光带,表明这些异恶唑探针标记了 BSA。这些结果共同表明异恶唑的光反应可以潜在地应用于蛋白质标记和化学蛋白质组学。
图1
化学蛋白质组学实验揭示了它们潜在的细胞靶标和相互作用。使用两种基于异恶唑的药物 Danazol 和 Luminespib应用于集成化学蛋白质组学平台,以揭示它们的细胞靶点和药物作用机制。5 μM 达那唑对 HEK 293T 细胞造成显着毒性。然后在 HEK 293T 细胞中用达那唑进行原位标记。标记图谱显示分布在 45-90 kDa 范围内的几个强荧光条带,表明达那唑的潜在细胞靶标。之后使用 HEK 293T 细胞用达那唑 (5 μM) 进行基于 TMT 的定量化学蛋白质组学实验。定量蛋白质组学分析富集了 48 个蛋白质命中作为达那唑的潜在细胞靶标。他们使用达那唑富集的两种蛋白质进行了下拉/蛋白质印迹 (WB) 验证。印迹显示 5 μM 达那唑显着富集细胞内 P53 和 PDIA1,表明它们与 HEK 293T 细胞中的达那唑潜在相互作用。此外,使用荧光 PDI 活性测定来测试达那唑的 PDI 抑制作用。isx10被用于基于 TMT 的定量化学蛋白质组学实验,以揭示其细胞靶点和相互作用。用 HeLa 细胞( isx10 /DMSO 和isx10 / isx10 + Luminespib)进行了两组化学蛋白质组学实验。用 STRING 数据库分析了这些蛋白质的相互作用。观察到 Hsp90、NASP、硫氧还蛋白 (TXN) 和 PTGES2 之间的相互作用。
图2
图3
总之,他们已经成功地将常见的药效团异恶唑基团开发成一种新型的光交联剂。首次详细研究了异恶唑与氨基酸、肽和蛋白质的光化学。功能化异恶唑探针的体外/原位蛋白质标记证明了异恶唑作为光交联剂的出色能力和效率。对两种含异恶唑的药物达那唑和 Luminespib 进行的化学蛋白质组学研究揭示了它们潜在的细胞靶标和相互作用。确定了达那唑的潜在蛋白质靶标,包括 TMF1、P53 和 PDI。特别是,达那唑被证实具有 PDI 抑制活性,这意味着 PDI 可能是达那唑的有效靶标。
作者:YXQ
责编:FJY
原文链接:https://doi.org/10.1002/anie.202209947
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