介绍一篇来自“ACS Central Science”的文章，题名为“Facile Preparation of UFMylation Activity-Based Probes by Chemoselective Installation of Electrophiles at the C‑Terminus of Recombinant UFM1”。

泛素折叠修饰物（UFM1）修饰蛋白质时出现的畸变与一系列疾病有关，但这种翻译后修饰物的生物学功能和调节，即UFM1化，仍然是个谜。为了提供UFM1化的活性探针，作者开发了一种在重组UFM1末端安装亲电弹头的新方法。通过选择性内切蛋白裂解和在pH3下用多种羧酸酐化学选择性酰化，很容易产生C端UFM1酰肼，不会损害折叠蛋白或在未保护的氨基酸侧链上发生反应。由此产生的UFM1活性探针对参与UFM1化过程的蛋白质显示出一系列可调反应性和高选择性，与Ub或其他Ubls相关的结构相关的E1s、E2s和蛋白酶未激活。UFM1探针在细胞裂解物和活细胞中均具有活性。先前无法接触的α-氯乙酰基探针对纤维素中去甲酰脲酶UFSP2活性位点半胱氨酸的共价修饰具有显著的选择性。

作者在 pH3 和室温的磷酸盐缓冲液中用 150当量的 α-氯乙酸酐处理 150 μM UFM1-酰肼1 （图2A ）。在几分钟内，观察到一个新物种2的干净形成，其质量对应于单次添加的 α-氯乙酰基。将修饰的蛋白质对 pH 7.4 的 Tris 缓冲液进行透析，以去除多余的小分子。完整蛋白质的 HRMS 进一步证实了选择性酰肼修饰（图 2B) 以及通过 MS/MS 分析对所得片段进行胰蛋白酶消化和分析，确定了 C 端酰肼作为酰化位点（图2D）。经修饰的蛋白质2保留了其折叠结构，如 CD 分光光度法所证明的 (图2C)。作者还测试了来自富马酸甲酯、缩水甘油酸、戊烯酸和乙酸酐的酸酐，所有这些都导致 UFM1 ΔG83 酰肼的单次添加和完全转化为酰化产物（图 3）。

图2

图3

作者重组表达了UFM1激活酶（E1）UBA5、结合酶（E2）UFC1、脱脲酰化酶UFSP2及其活化失活突变体（C→A） 作为控件。首先测试了带有UBA5的探针2-5及其催化活性变体C250A。α-氯乙酰基探针2和富马酸盐探针3与UBA5反应，3更广泛地耦合（图4A）。炔烃与DUB具有良好的反应性，与E2无反应性；因此，作者测试了可能更具反应性的带有UFC1的探针2−4及其催化活性变体C116A。探针3与UFC1反应；然而，由于具有催化活性的UFC1变异体C116A与探针3的反应同样有效（图4B），因此该反应不具特异性。这表明富马酸探针3太亲电，可能与表面暴露的半胱氨酸残基结合。作者测试了探针2−5，含去甲酰脲酶UFSP2及其催化失活变体C302A。探针2因为它选择性地和高效地反应，消耗了所有的UFSP2（图4C）。α-氯乙酰基探针2被证明对UFSP2具有高度选择性，并且对其他共轭酶和去共轭酶没有明显的反应性（图4D）。因此，作者确定UFSP2的修饰半胱氨酸为活性位点C302。作者将探针2进行了体外交联反应，然后进行胰蛋白酶消化，并通过MS/MS分析所得片段（图4E）。

图4

受UFM1衍生探针对已知参与UFM酰化途径的酶的特异反应的鼓舞，作者评估了它们在全细胞裂解物和活细胞中的活性。作者使用了野生型HCT116、UFM1敲除（KD）HCT116和UFM1 KD HEK293T细胞系，这些细胞系是用CRISPRi（dCas9 KRAB）产生的。通过抗FLAG Western blotting对UFM1 KD实验进行可视化，α-氯乙酰基探针2和富马酸盐探针3在55kDa以上显示了强条带（图5A）。为了鉴定探针2标记的蛋白质，作者使用电穿孔法将我们的探针导入活的HEK293T UFM1 KD细胞。采用含UFSP2 KO的HEK293T细胞系进行对照实验。仅在存在UFSP2和α-氯乙酰基探针2的情况下，使用Western blot对UFSP2-和UFSP2/进行裂解后的交联蛋白进行可视化，显示出明显的条带。在乙酰化UFS16或不存在UFSB2的情况下未观察到条带（图5B，C），证实了探针2对UFSP2的特异性捕获。作者使用无标签定量法，通过FLAG-IP鉴定最丰富的蛋白质。探针电穿孔和IP一式三份。UFSP2是人类的一种UFM1蛋白酶，是经鉴定的最丰富的蛋白质（图5D）。

图5

总之，作者开发了一类新的UFM1衍生的ABP，包括α-氯乙酰衍生物，该衍生物对去甲酰脲酶UFSP2具有特殊的选择性。这种探针在细胞裂解物中或电穿孔到活细胞中时也能很好地工作，这将使它能够作为一种表型工具来询问UFSP2的作用。重要的是，与采用硫代酯氨解的相关方法相比，该方法与产生高度特异性UFM1 ABP所需的空间位阻C末端缬氨酸残基兼容。

本文作者：QHJ

责任编辑：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c00203

DOI: 10.1021/acscentsci.2c00203