分享一篇2022年发表在Analytical Chemistry上的文章，题目是“Dual-Channel Recognition of Human Serum Albumin and Glutathione by Fluorescent Probes with Site-Dependent Responsive Features”，文章的通讯作者为汪乐余教授。
方案1 用于识别具有优化响应的 HSA 和GSH的探针 M–OH–SO3示意图人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 由肝脏合成，是血浆中含量最丰富的蛋白质，在维持胶体渗透压、调节自由基和运输营养物质等日常生理活动和新陈代谢中起着至关重要的作用，已被广泛探索用于治疗它与小分子的相互作用。HSA水平的异常变化预示着心脏病、高血压、肝硬化、癌症等疾病的发生。HSA 蛋白的一个关键特征是它的疏水腔，HSA 与小分子的结合会显着扰乱分子探针的局部环境。在这方面，基于二氰基异佛尔酮的荧光团特别有趣，因为它们的光学特性强烈依赖于它们的环境变化，如极性或粘度。作者制备了具有大斯托克斯位移的双通道响应荧光探针M–OH–SO 3 ，由荧光报告基因（二氰基异佛尔酮）、二硝基苯磺酸酯部分和羟甲基（调节剂）组成，显示黄色（ HSA 在 400 和 500 nm 激发下的发射分别为 575 nm）和红色（660 nm）（方案 1）。通过在苯酚部分的邻位筛选一系列官能团来优化探针对HSA的响应，其中具有羟甲基（M-OH-SO 3）的探针具有最佳性能。分子对接分析显示M–OH–SO 3显示出最低的结合能，即最强的亲和力。此外，探针M-OH-SO 3也可用于GSH识别，这也表明HSA的识别可能与蛋白质上存在的硫醇基团有关。这样的设计方案表明，通过在识别组的相邻位点对探针进行轻微修改，可以显着改变探针的选择性，从而为探针优化提供了一种简便的方法。图 1. (A) 二氰基异佛尔酮衍生探针的化学结构。(B)在500 nm 激发下添加HSA 和 BSA的探针M–OH–SO 3和M–SO 3的荧光光谱。[探针] = [蛋白质] = 20 μM。( C )在与20 μM浓度的分别为BSA 或 HSA。[探针] = 20 μM。(D) M–OH–SO 3的荧光寿命变化与HSA (200 μg/mL)相互作用前后。[探针] = 20 μM。(E) 通过测量不同比例的M–OH–SO 3和 HSA 混合物的荧光强度（λem = 660 nm）进行 Job 曲线分析，而混合物的总浓度保持在 20 μM。(F)通过添加位点特异性标记（水杨酸、华法林和布洛芬，1–200μM），M–OH–SO 3 –HSA复合物 (20 μM)的荧光强度发生变化。鉴于 HSA 蛋白经常被报道为药物载体，我们旨在设计一种结构类似于药物分子的荧光探针，这将增强探针与 HSA 蛋白之间的结合亲和力。考虑到这一点，通过在 HSA 的典型配体酚类部分的邻位引入一个 −CH 2 OH 基团，制备了一系列二氰基异佛尔酮衍生的荧光探针 ( M–OH–SO 3 )。作为比较，化合物M–SO 3、M–H–SO 3和M–F–SO 3的合成如图 1 A 。由于蛋白质 BSA 和 HSA 具有高度相似的结构，作者首先分别探讨了探针对 HSA 和 BSA 的选择性。对于探针M–OH–SO 3，在与 HSA 孵育后观察到发射强度显着增强。尽管蛋白质 BSA 和 HSA 的结构相似，但M–OH–SO 3仅显示出对 BSA 的适度荧光增强（图 1 B）。然而，探针M–SO 3对 BSA 和 HSA 均显示出微弱的发射，这表明探针的结构对响应以及对 HSA 的选择性有很大影响。。因此，在特定位点设计化学结构不仅可以改善探针与蛋白质之间的相互作用，还可以显着提高 HSA 和 BSA 之间的选择性。定量比较结果表明，M–OH–SO 3的荧光增强660 nm 处的 HSA 约为 67 倍，BSA 约为 23 倍（图1C）。尽管如此，M-SO 3对BSA和HSA的荧光增强分别为7倍和9倍，远弱于M-OH-SO 3。作者推测 HSA 与基于二氰基异佛尔酮的探针之间的相互作用导致分子运动受限，从而通过阻断分子内扭曲内部电荷转移 (TICT) 过程减少非辐射跃迁的能量损失，表现出增强的荧光。如图 1 D所示， M–OH–SO 3 –HSA与游离的 M-OH-SO 3相比，复合物表现出更慢的荧光延迟和更长的 2.011 ns寿命，更短的寿命为 0.399 ns。这些结果表明，探针与 HSA 的疏水腔之间的相互作用可以抑制 TICT 过程，从而导致M–OH–SO 3发射增强。此外，HSA 蛋白上的硫醇基团也可以促进二硝基苯磺酸的裂解，这也有助于观察到 660 nm 处的增强发射。因此，疏水腔和硫醇诱导的裂解的协同效应可能是与 HSA 孵育后M–OH–SO 3发射增强的原因。由 HSA 和M–OH–SO 3形成的复合物的化学计量比使用 Job's plot 分析测量，表明M–OH–SO 3和 HSA 主要形成 1:1 的复合物（图 1 E）。已知HSA具有不同的结合位点，其中主要的结合位点位于IIA和IIIA亚结构域的疏水腔内。为了探索 HSA 对M–OH–SO 3的潜在结合位点，通过竞争性结合试验使用了三种药物抑制剂（华法林，IIA 域标记；水杨酸，IB 亚域和 IIA 位点标记；布洛芬，IIIA 位点标记） .(40)荧光强度变化表明M–OH–SO 3与 HSA 的三个位点 IIA 和 IIIA 结合（图 1 F）。
图 2. (A) 立体视图，(B) 特定残基，和 (C) 探针M–OH–SO 3在与 HSA 络合后的氢键相互作用。探针M–SO 3与 HSA 络合后的立体视图 (D)、特定残基 (E) 和氢键相互作用 (F) 。为了获得更多的结合信息，使用Autodock Tool进行分子对接，模拟HSA与探针的相互作用（图2）。结果表明，M–OH–SO 3、M–SO 3和M–F–SO 3倾向于与 HSA 的 IB 位点结合（图 2 A–C ），而M–H–SO 3形成在 IIIA 位点与 HSA 复合，这与观察到的M-H-SO 3在 HSA 存在的情况下显示出 678 nm 处的最大发射，而其他人则显示出 660 nm 处的发射。图3. HepG2 细胞的共聚焦图像。(a–c) 细胞与探针M–OH–SO 3孵育30 分钟。(d–f) 细胞在用辛伐他汀 (10 μM) 处理 24 小时后，用探针M–OH–SO 3孵育 30 分钟。[探针] = 20 μM。荧光通道：610–700 nm，λ ex = 488 nm。(g) (b,e) 中荧光强度的定量比较。(h–j) 细胞与探针M–OH–SO 3 (20 μM) 孵育 30 分钟。(k–m) 细胞在用 GSH (1 mM) 处理 30 分钟后用探针M–OH–SO 3 (20 μM) 孵育 30 分钟。荧光通道：520–600 nm，λ ex = 405 nm。比例尺：25 微米。(n) (i,l) 中荧光强度的定量比较。鉴于 HepG2 细胞具有 GSH 过表达和 HSA 含量低的特征，进一步表征了探针M–OH–SO 3监测 HepG2 细胞中药物诱导的 HSA 和内源性/外源性 GSH 变化的能力。将 HepG2 细胞与M–OH–SO 3孵育30 分钟后，在 500 nm 的激发波长下观察到红色荧光（图 3 a–c），这可归因于内源性 HSA 诱导的发射变化。在此基础上，诱导细胞内HSA过度表达的药物辛伐他汀，用于在探针处理前处理细胞 24 小时。正如预期的那样，观察到红色发射显着增加（图 3 d-g）。当激发波长切换到 400 nm（图 3 h-j）时，获得了微弱的黄色发射。当在与M–OH–SO 3孵育之前添加外源性 GSH 时，我们发现细胞中的黄色发射明显增加（图 3 k–n）。综上，在这项工作中，提出了一种对人血清白蛋白 (HSA) 具有双通道光谱响应的荧光探针 ( M–OH–SO 3 )。通过使用二硝基苯磺酸盐作为识别位点和荧光猝灭剂，探针M-OH-SO 3显示出微弱的荧光，然而，在 400 激发下，它向 HSA 显示出广泛的黄色 (575 nm) 和红色 (660 nm) 荧光发射和 500 nm，分别。有趣的是，M–OH–SO 3对 HSA 表现出最佳性能，选择性明显高于其对应物M–SO 3、M–H–SO 3, 和M–F–SO 3 , 它们是通过调节双氰基异佛尔酮核心邻位的官能团而制备的。分子对接结果表明，M–OH–SO 3在所测试的衍生物中具有最低的结合能，因此具有最强的结合亲和力。探针M–OH–SO 3在 0.5–18 μM 范围内与 HSA 呈良好线性关系，检测限为 35 nM。细胞成像结果表明，探针M–OH–SO 3可以显示肝癌细胞中 HSA 水平的变化。此外，探测M–OH–SO 3也可用于通过二硝基苯磺酸基团的裂解以及 575 nm 发射的增强来识别谷胱甘肽。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c02025
目前评论：