Angew. Chem. Int. Ed.|新型生物正交镧系分子探针用于近红外荧光和质谱成像

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分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上题为Bioorthogonal Lanthanide Molecular Probes for Near-Infrared Fluorescence and Mass Spectrometry Imaging的文章。文章的通讯作者是北京大学的陈兴教授、张俊龙教授和中国科学院化学研究所的赵耀副研究员。

荧光显微镜具有较高的时间和空间分辨率,可以选择性地监测生物过程,所以开发具有特定光物理性质的新型荧光探针十分重要。近红外(NIR700-1700nm)荧光团具有深层组织穿透、低光子散射和自身荧光可忽略的特点而受到广泛关注。同时,将成像扩展到近红外区域有望打破传统荧光团的光谱重叠,同一样品中最多有五种荧光颜色的色障。目前可用的近红外荧光团往往存在生物相容性差、化学和光稳定性不足和量子产率低的问题。因此,研制高亮度、高稳定性的近红外荧光团具有重要的意义。近红外发射镧系络合物具有荧光寿命长、尖利而有特征的发射峰的特点,是近红外荧光团中很有发展前景的化合物。作者将叠氮基和炔基等生物正交官能团安装到镧系元素配合物上,通过点击化学与目标生物分子结合,进行特异性标记,实现了多色成像以及膨胀显微成像(Click-ExM),并成功将近红外荧光成像和质谱成像结合,实现了亚细胞分辨率的双模态成像。

首先作者以F28TPP作为天线配体和氘化的Kläui辅助配体(1a),用三个Ln(Ln=Yb3+Nd3+Er3+)离子合成了近红外Ln络合物(Yb-1, Nd-1Er-1)Yb-1Nd-1Er-1在二甲基亚砜(DMSO)420 nm激发时,在900-1050 nm1030-1130 nm1450-1600 nm表现出特征近红外荧光,量子率分别为21.2%0.86%0.01%(图2a2d)。在DMSO中,Yb-1980 nm处显示出259 µs的最长寿命,Nd-11067 nm处具有4 µs69%)和14 µs31%)的双指数寿命,Er-11530 nm处表现出最短的10 µs寿命。由于卟啉配体在可见区的高共同作用,Yb-1Nd-1Er-1的亮度高达71287 L·mol-1·cm-12365 L·mol-1·cm-126 L·mol-1·cm-1(图2c)。但这些NIR Ln络合物的水溶性较差,与生物体系不相容。为了增加探针的亲水性,通过使用表面活性剂DSPE-PEG-2000将这些Ln络合物分散在水溶性磷脂胶束中。在532 nm处激发水中Yb-1Nd-1Er-1的磷脂胶束,近红外图像显示Nd-1Yb-1的近红外荧光较强,而Er-1的近红外荧光较弱(图2b)。基于这些结果,作者选择Yb络合物作为亲本分子,制备了可点击的近红外Ln络合物。
在生理条件下,探针的亲水性对生物正交标记至关重要。于是作者在卟啉中位引入了带正电的铵基以提高水溶性,同时在中位安装了炔基或叠氮基,合成了三种Yb3+络合物Yb-2,Yb-3Yb-4(图1b),收率分别为51%53%87%。其中Yb-2含有一个炔基,Yb-3Yb-4分别含有四个炔基和叠氮基,而且他们表现出相似的紫外/可见吸收光谱,近红外荧光量子产率高和消光系数大,Yb-2, Yb-3Yb-4是迄今为止最亮的可点击Yb3+络合物。

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1.a) Yb-1/Nd-1/Er-1的合成路线。b)水溶性和可点击Yb-2/-3/-4络合物的合成路线。
接下来,作者研究了Yb-2Yb-3Yb-4的水溶性。在PBS中观察到的Yb-3Yb-4的荧光强度和荧光寿命比在DMSO中大幅降低,相比之下,疏水的Yb-2下降幅度不大。作者假设水的O-H键振动可以有效地猝灭亲水性Yb-3Yb-4的近红外发射,而疏水性的Yb-2容易在水中聚集,从而阻止了水对荧光的猝灭。Yb-3Yb-4的荧光强度在与各种代谢前体点击共轭后增加了约3-4倍,显示了良好的荧光性。此外,Yb-3Yb-4表现出良好的pH稳定性、光稳定性和低细胞毒性。这些特性使它们成为生物系统中生物正交标记的理想选择。2

图2. a)Yb-1、Nd-1和Er-1在DMSO中的归一化近红外荧光发射光谱。b)溶解在水溶性磷脂胶束中的Ln-1的近红外荧光图像。c)近红外Ln络合物的紫外/可见吸收光谱。d)近红外Ln络合物光物理性质和正辛醇/水中的分配系数。
为了评估可点击Yb3+络合物在生物正交标记中的适用性,作者通过水中的点击反应测试了Yb-2Yb-3Yb-4与各种非自然代谢前体的结合(3a)。高分辨率质谱(HRMS)证实了相应的Yb-3Yb-4共轭物的形成,但没有Yb-2共轭物的形成,Yb-2的聚集可能阻碍了点击反应。紫外/可见吸收光谱和近红外发射光谱表明,与非自然类似物的点击连接对Yb3+络合物的吸收、激发、发射和发光衰减曲线影响不大。说明探针可用于生物正交标记。
然后,作者使用可点击的Yb3+络合物来标记与非典型氨基酸叠氮同丙氨酸(AHA)孵育的HeLa细胞中的新生蛋白质,AHA作为甲硫氨酸替代氨基酸,并被代谢纳入新合成的蛋白质中。经CuAACYb-3进行点击反应后,在AHA处理的细胞中观察到显著的近红外荧光,而在未进行AHA处理但使用Yb-3进行相同点击反应标记的细胞中几乎观察不到信号(图3b)。结果表明,Yb-3成功地标记了新合成的蛋白质。随后,作者扩展了Yb3+的应用,用来标记聚糖和DNA。用一系列非天然类似物(GalNAzSiaNAzEdUEU)对细胞进行标记,并用Yb-3Yb-4进行点击反应连接来进行检测荧光(图3b)。近红外荧光结果与先前报道的荧光探针一致。

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3.a) Yb3+络合物通过生物正交化学标记代谢标记生物分子示意图。b)一系列生物分子的近红外图像。
为了避免活细胞中点击标记过程中可能的铜毒性,作者基于SPAAC反应在NIRF成像中评估Yb-4的效果,也称为无铜点击。通过DBCO-Sulfo-NHS酯共价标记HeLa细胞的表面蛋白与Yb-4进行SPAAC反应,在细胞表面观察到Yb-4强烈的近红外荧光,说明Yb-4成功标记了膜蛋白(图4a)。同时,作者还通过DBCO功能化的链霉亲和素实现了免疫荧光成像,可清晰显示亚细胞微管蛋白网络(4b)。该方法也适用于线粒体等细胞器的近红外成像。

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4.a) SPAAC实现Yb-4点击标记细胞膜蛋白示意图。b) Yb-4近红外免疫荧光标记α-微管蛋白示意图。
近红外荧光团的一个优势特征在于它们与可见光区荧光团结合的多色成像能力。为了证明这一观点,作者将Yb-3Yb-4的点击标记与免疫荧光染色结合起来。在SiaNAz处理的COS-7细胞中,细胞表面的唾液聚糖被Yb-3点击标记,结合组蛋白H3蛋白免疫染色、MitoTracker Orange染色和Hoechst 33342染色,在同一细胞的细胞表面、细胞核、线粒体和DNA上可以清晰地观察到强烈且定位准确的荧光信号(图5)。结果表明,可点击的Yb-3Yb-4可与各种荧光染色和标记程序结合使用,用于包括组蛋白H3蛋白、细胞核、线粒体、内质网和α-微管蛋白在内的不同细胞靶点成像。

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图5.不同细胞靶点多色近红外成像。

由于阿贝衍射极限,NIRF成像的分辨率往往较低,阻碍了NIRF对精细生物结构的成像。缺乏合适的近红外荧光团也限制了目前在近红外区域的高分辨率显微技术,北京大学陈兴教授课题组此前开发了点击膨胀显微镜(Click-ExMNat. Methods 2021, 18, 107-113)通过物理扩展嵌入可溶胀聚合物水凝胶中的生物样品,可在衍射受限显微镜上实现高分辨率成像,而无需复杂的仪器和算法。基于点击化学利用Yb3+探针进行膨胀显微成像(图6a),对细胞中唾液酸修饰的糖蛋白进行了高分辨的NIR荧光成像,用SiaNAz处理HeLa细胞,与Yb-3进行点击反应,然后使用U-ExM方法进行固定和膨胀,Yb3+的近红外荧光被很好地保留,细胞膜上的唾液糖蛋白可以被更好地分解(图6b)。结果证明了Yb3+探针在近红外ExM成像中的潜力(图6c6d),进一步提高将ExM成像拓展到NIR窗口的可能性。

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图6. HeLa细胞中SiaNAz标记唾液酸修饰糖蛋白近红外膨胀显微成像(Click-ExM)a)Click-ExM工作流示意图。b) HeLa细胞中SiaNAz标记的唾液糖蛋的Click-ExM图像。c) Yb-3沿b中蓝色或橙色线的荧光强度分布图。d) Yb-3的荧光强度曲线在b中的绿线或天蓝线上对应拟合的高斯曲线。

二次离子质谱(SIMS),是一种高分辨率的表面分析技术,Ln元素及同位素选择广泛,且在人体中自然丰度较低。其中ToF-SIMS(飞行时间二次离子质谱仪)的一个优点是可以在宽m/z范围内检测冻干细胞的所有离子,无需树脂包埋,使原位成像细胞成为可能。作者通过代谢标记和点击化学研究了可点击Ln络合物在特定生物分子ToF-SIMS成像中的性能。他们首先测量了Yb-3ToF-SIMS光谱,观察到由Yb3+络合物产生的大量重组片段离子,其同位素分布一致。为了可视化新生蛋白质,HeLa细胞被AHA代谢标记,Yb-3点击标记,然后冻干ToF-SIMS成像,检测到了[YbF4]-特征信号,其成像结果与NIR成像结果一致。与Yb-3类似,通过用Yb-4点击标记,新生DNARNAToF-SIMS成像也在EdUEU标记的HeLa细胞中实现(图7)。这些结果也表明了Yb3+探针通过与不同的非自然类似物结合来标记其他生物分子的巨大前景。7
7.HeLa细胞中各种代谢标记生物大分子的ToF-SIMS图像及其相应的阴性对照。
虽然ToF-SIMS成像可用于标记生物分子的成像,但很难区分精确的亚细胞分布。作者提出利用ToF-SIMS与荧光成像的相关性进行定位,将Hela细胞接种在可寻址的共聚焦培养皿上,与EdU一起孵育并点击标记上Yb-4,然后将细胞冻干用于新生DNANIRFToF-SIMS成像(8a),可以观察到新生DNA的强NIR荧光信号(8b),与Hoechst 33342标记的细胞核核具有良好的共定位。通过对齐和合并NIRFToF-SIMS图像,[YbF4]-信号几乎与NIRFHoechst通道共域,核外微弱的信号可能来自Yb-4的轻微非特异性结合。作者实现了将该类稀土分子探针应用于细胞中生物分子的ToF-SIMS成像,实现NIR荧光成像和SIMS成像的结合。8

图8. Yb-4在EdU代谢标记的HeLa细胞中对新生DNA进行NIRF-ToF-SIMS双模态成像。a)同一细胞的相关NIRF成像和ToF-SIMS成像工作流程图。b) Yb-4的近红外强荧光图像。

综上所述,作者开发了一系列具有高近红外荧光亮度的可点击Ln络合物,适用于细胞内靶向分子的生物正交标记。这些Ln络合物的可点击性和良好的亲水性确保了生物分子(如蛋白质、聚糖和核酸)的特异性结合,在水性介质或细胞中通过点击反应进行标记,还可用于多色成像。良好的光学特性和生物正交性使得ExM在近红外区域的成像成为可能。此外,良好的近红外荧光响应和独特的同位素分布使这些Ln络合物成为双模态NIRF-SIMS成像的理想分子探针。

原文链接:https://doi.org/10.1002/anie.202208707


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