分享一篇发表在Nature Communications上的文章，标题为 “THRONCAT: metabolic labeling of newly synthesized proteins using a biorthogonal threonine analog”, 文章的通讯作者是来自荷兰奈梅亨拉德伯德大学化学生物学实验室的Kimberly M. Bonger教授；Kimberly M. Bonger教授主要从事配位辅助生物正交化学、选择性靶向自身反应性B细胞、化学酶亚细胞蛋白标记的相关研究。在本文中，作者主要是介绍了一种基于生物正交苏氨酸类似物β-乙炔丝氨酸（βES）的苏氨酸衍生的非规范氨基酸标记方法，该方法能够在几分钟内有效地标记培养基中的新生蛋白质组。

图1 蛋白代谢标记流程图

图3 使用THRONCAT可视化哺乳动物细胞中的NSP

接下来，作者使用THRONCAT富集和检测HeLa细胞的NSP，并将鉴定出的蛋白质与在基于质谱的蛋白质组学设置中使用BONCAT时观察到的蛋白质进行比较。为此，作者将HeLa细胞在完整的培养基中与βES孵育4小时，富集NSP并对消化的肽进行LC-MS / MS分析（图4），对已鉴定的NSP的基因本体分析显示主要细胞区室的全面覆盖，并显示出与BONCAT鉴定的NSP相似的亚细胞分布，证实了βES在整个蛋白质组中的广泛掺入。单个重复比较表明，在所有三个重复中都发现了~83%的NSP，在至少90个重复中发现了~2%，表明良好的实验重现性。作者确定鉴定蛋白质的平均苏氨酸含量为5.20%，与人类蛋白质组的苏氨酸含量相同，表明THRONCAT富集不偏向于富含苏氨酸的蛋白质。

图4 用THRONCAT对新生哺乳动物蛋白质组进行质谱分析

最后，作者探讨了βES是否被掺入黑腹果蝇的NSP中，黑腹果蝇是一种活的和行为良好的模式生物，具有丰富的遗传工具包。作者在含有371 mM βES的果蝇培养基上喂食在运动神经元中选择性表达膜系系绿色荧光蛋白的第二龄晚期/第三龄早期果蝇幼虫4小时（图5）。标记后，幼虫中枢神经系统（CNS）和体壁肌肉中的NSP与TAMRA-叠氮化物（TAMRA-N）结合，与未处理的对照组相比，共聚焦显微镜结果显示，与未处理的对照组相比，用4 mM βES孵育的幼虫的腹侧神经索（VNC，相当于脊椎动物脊髓）和体壁肌肉中都有强大的THRONCAT标记（图5）。由于运动神经元中蛋白质合成（缺陷）与神经肌肉疾病的相关性，作者决定将后续研究重点放在VNC中的运动神经元上。观察到βES在运动神经元中的掺入（图5），其具有很强的浓度依赖性，在βES（90.10 mM）浓度降低0倍时降低~4%（图5）。最后，作者确定了延长的THRONCAT标记是否会影响果蝇的健康或发育。在4小时时间范围内向幼虫施用48 mM βES既不影响神经肌肉接头形态或突触长度，也不影响运动神经元细胞体面积，但适度影响幼虫生长并诱导轻微发育迟缓，而向成年果蝇施用4 mM βES48小时不影响运动性能。

图5 THRONCAT可以对黑腹果蝇的蛋白质合成进行体内分析

综上所述，作者介绍了THRONCAT，这是一种基于生物正交苏氨酸类似物βES的非规范氨基酸标记方法，该方法可以在几分钟内在完整的生长培养基中对新合成的蛋白质进行有效标记。除了便捷性之外，作者预计βES在NSP中的有效掺入为检查目前难以研究的模型中的细胞反应和机制创造了机会。