分享一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，文章标题为 “Precise, Orthogonal Remote-Control of Cell-Free Systems Using Photocaged Nucleic Acids”。本文作者是来自伦敦大学化学院的Michael J. Booth教授，他的课题组主要研究的是如何控制核酸以及研究如何将药物通过合成细胞输送到天然细胞中。本文主要开发了一种在无细胞表达中的光控OFF开关，联合近期同期刊发表的蓝光激活DNA模板的ON开关(https://doi.org/10.1021/jacs.3c02350)，实现了无细胞蛋白表达的远程控制。

图 1 紫外光和蓝光激活的反义寡核苷酸（ASO）

为了增加ON/OFF的比，作者在ASO中增加了一个amino-C6-dT。此外，还筛选了一个针对相同的mRNA区域的新的ASO(mV220和mV229)，新的ASO具有更高的效力，胸腺嘧啶更密集，在序列中分布更对称。其中V2和V3分别是4个胸腺嘧啶被amino-C6-dT替代的mV220和mV229。将之前(V1)和新设计的(V2和V3)的序列用uvLA-biotin进行修饰，然后让mSA结合(图2a)。改良后的 uvLA-V3的ON/OFF比最好(图2b)，选择V3进行进一步实验。在没有光照的情况下，使用uvLA-V3时，mRNA转录水平与没有ASO的情况相似，而在光照后发生体外转录翻译时，看到了与V3一样的mRNA降解。在没有紫外光的情况下，uvLA-V3蛋白质合成仅降低了15%（不显著，p-value=0.084），而在紫外线照射5 min时，与no ASO组相比，蛋白质合成降低了75%，与V3相比， ASO活性恢复了84%(图2c)。这些结果表明，能够使用光激活的ASO来控制CFPS的基因敲除。

图2 光激活反义寡核苷酸（LA-ASO）介导RNase H降解 mRNA和无细胞蛋白合成（CFPS）的反应活性。

紧接着作者设想了一个可以用蓝光选择性地开启转录，用紫外光关闭翻译的系统(图3)。作者证明了bLA-T7启动子用的蓝光与本文中的uvLA-V3 ASO的光谱具有正交性后，将bLA-mV DNA模板，uvLA-V3和RNase H放在CFPS系统中，在37°C，在不同光照条件下孵育4小时，并通过荧光测量完整的蛋白产量。由于在蓝光下uvLA-V3没有被激活，仅用蓝光照射与没有ASO对照组的蛋白质的表达相同。单独用紫外光照射并不能激活bLA-mV DNA模板，4h后没有产生蛋白，因为只有ASO被激活。在蓝光激活模板后，在不同的时间点应用紫外线，通过降解已经生成的mRNA来停止蛋白质的合成。当在蓝光激活后30min用紫外线照射时，蛋白质合成了没有ASO存在时蛋白表达量的51%。这证明了CFPS的双波长开关，具有激活和停止蛋白质合成的能力。

最后，作者生成两个ASO，它们分别可以结合不同的mRNA，并在每个波长选择性地降解它们的目标(图4a)。其中一个ASO序列可以靶向编码红色荧光蛋白mCherry（mC）的mRNA，而不结合mV-mRNA。mC来源于不同生物体的荧光蛋白，与mV具有正交的激发/发射光谱，DNA序列也有很大差异。用图1的方法进行修饰ASO后分别形成了bLA-C1和uvLA-V2。mV和 mC的mRNA与两种ASO和RNase H同时孵育，以检测光控制的mRNA降解（图4b）。在没有照射的情况下，两种mRNA都保持完整。在蓝光照射下，mC-mRNA被降解，而mV-mRNA保持完整。在紫外光照射后，mV-mRNA被选择性降解，而mC-mRNA无降解。最后，作者将mV和mC的DNA模板、bLA-C1、uvLA-V2和RNase H加入到CFPS系统中，在不同的光照模式下孵育4h，并测定两种蛋白的荧光(图4c-d)。在没有光照的情况下，与没有ASO组观察到的一样，这两种蛋白的表达水平相似。在紫外线照射下，uvLA-V2选择性地敲除了mV荧光56%；在蓝光照射下，bLA-C1选择性地敲除mC荧光62%。综上可以表明能够使用两个正交光控制的ASO来控制CFPS系统中的基因敲除。