首先，FXR受体是核受体超家族的一员，是一种重要的配体激活转录因子，主要在肝脏，肠道以及肾上腺中高度表达。在结合配体后，FXR会进入细胞核与靶基因的启动子结合，从而调节他们的转录。其表达水平受到许多因素的影响，比如饮食与昼夜节律。同时FXR还与胰岛素抵抗，炎症，细胞凋亡等生物学现象有关，因此这些特征也使其成为了诸如胆管炎，肥胖，非酒精性脂肪肝等疾病治疗的重要靶点。但是目前没有一种可以在体内实时监测FXR的方法，因此也限制了我们对FXR生理与病理学功能的研究。

此外，FXR受体还存在转录非依赖性功能，即其蛋白质水平，而非其转录活性所带来的生理学功能。因此对其表达水平的实时监测是至关重要的。目前对蛋白质表达水平进行监测的主要方式是Western Blot和免疫组织化学或者免疫荧光染色。但是Western Blot需要进行细胞裂解，无法对活细胞进行监测。而免疫组织化学或免疫荧光染色虽然可以做到活细胞监测，但需要制备特异性抗体，工序繁琐。

基于以上问题，作者团队设计开发了一个特异性结合FXR的具有光反应性的可点击化学探针，成功实现了对细胞中FXR表达的监测与原位标记。

OL2和OLNCA探针的设计与合成。

首先一个良好的生物正交光亲和探针通常需要具有以下三个特征，即（1）可以特异性的且高效的与目标蛋白进行结合。（2）可以在外部激活信号下通过共价结合的方式与目标蛋白进行结合从而实现探针对蛋白的锚定。（3）可以通过Click反应与荧光分子或生物素等报告分子进行结合。因此，为了满足这三点要求，作者选择了OCA这种FDA批准的高选择性FXR激动剂作为探针合成的底物以实现特异性结合FXR受体。其次对其修饰上双吖丙啶以及炔基，利用双吖丙啶实现光交联，炔基实现Click报告。基于这一思路，作者先后合成了OL2探针以及通过点击化学对OL2引入荧光基团后得到的OLNCA探针。

OLNCA的荧光特性以及OL2与FXR-LBD重组蛋白的结合亲和力。

通过检测OLNCA，OL2以及NCA的荧光特性，作者发现OLNCA在440nm处具有强吸收，以及520nm处有着强荧光，其荧光发射强度几乎是NCA的10倍，这很可能是由于NCA通过Click反应与OL2结合后形成了更大的共轭体系，使得电子离域性进一步增强所致。由此确定了OLNCA具有较好的荧光特征，满足荧光标记的需求。而后作者使用生物膜层干涉测量技术(BLI)研究了OL2与FXR-LBD重组蛋白的结合能力，结果显示探针与FXR-LBD重组蛋白的结合能力具有较高的Kd值，这表明两者具有较高的结合能力。

探针OL2在HepG2细胞中对FXR的生物成像。

鉴于FXR-LBD重组蛋白与OL2以及OLNCA的结合能力检测的优良结果，作者决定对HepG2人肝癌细胞系使用该探针进行成像，这也符合FXR在肝脏中高表达的特点。为了验证OL2确实可以和细胞中的FXR蛋白结合，作者分别使用OL2+NCA以及FXR抗体对细胞共同进行孵育，发现荧光具有高度重合性，这就表明OL2与FXR可以发生良好的特异性结合。

由于上述实验都是在固定细胞中进行，为了检测活细胞中探针的功能，作者使用OLNCA对活细胞进行实验。据研究表明，FXR的表达在各种肝病中被显著抑制，为了检测该策略是否可以监测生理和病理学条件下FXR的表达，作者首先采用LPS处理HepG2细胞诱导其炎症反应，而后利用探针对其荧光强度进行检测。试验结果表明Western Blot中蛋白条带明显变淡，荧光强度也有显著下降。

总之，本文中作者成功开发了一种选择性FXR特异性结合的光反应性可点击化学探针，并成功做到了FXR的原位成像以及亚细胞定位。这一方法不仅有利于FXR药物研发，同时也可以应用于其他核受体的研究。

文章作者：QJL

原文引用：10.1021/acs.analchem.2c01206