分享一篇本课题组近期发表在RSC Chemical Biology上的题为“A light-initiated chemical reporter strategy for spatiotemporal labeling of biomolecules”的文章。在这项工作中，作者开发了连续光激活生物正交报告标记策略(sequential photoirradiation-orthogonal reporter tagging, SPORT)。该策略将光化学反应与代谢标记方法相结合，实现了可见光对细胞表面聚糖、脂质和蛋白质标记的时空控制，有助于以高时空分辨率监测复杂生命系统中的生物分子。

随着近年来化学生物学领域的飞速发展，各种用于探测、操纵生物分子的化学生物学方法层出不穷。其中，生物正交反应与代谢标记相辅相成，已经被广泛应用于蛋白质、聚糖、脂质等生物分子的研究之中。但是，由于很难实现对生物分子标记的时空控制，此方法在研究生物体内特定时间空间的特定生理活动方面具有一定的局限性。为此，已有研究人员开发出带有光诱导点击反应基团的代谢前体用于生物分子的时空可控标记，但是，考虑到部分光点击反应基团的体积较大，只有少量基团可以在保证代谢效率与表达水平的前提下实现生物分子的标记。因此，开发一种不受代谢标记限制的通用的光激活标记策略将为监测复杂生命系统中的生物分子提供帮助。

为此，本文提出了连续光激活生物正交报告标记策略，该策略首先将经典的带有叠氮或炔基的代谢前体分别整合到蛋白质、聚糖及脂类等分子上，然后通过生物正交反应在相应分子上修饰光活性基团，从而实现后续的生物分子的时空可控标记。这里，我们选择了最近报道的可见光催化的9,10-菲醌(PQ)与富电子乙烯醚的[4+2]环加成反应，该反应具有反应速率快，生物相容性好，与叠氮炔基的反应相正交，以及可以使用LED灯激活等优点。

图1 SPORT策略示意图及代谢前体分子结构和光点击反应方程式

首先，我们通过细胞聚糖的标记验证SPORT策略的可行性。Ac₄ManNAz是细胞内唾液酸聚糖的经典报告分子，通过Ac₄ManNAz在细胞内的代谢，叠氮基团被整合到唾液酸聚糖上，通过SPORT策略实现对细胞表面唾液酸的表征。由于不同细胞系的唾液酸表达水平存在差异，我们分别在唾液酸高表达的HCCC-9810细胞系与唾液酸中度表达的A549细胞系中进行验证。根据前述流程，我们首先利用共聚焦成像验证了SPORT策略的可行性。结果表明，在VE与光照同时存在的条件下，唾液酸聚糖可以被Alexa Flour-488标记，这是SPORT策略的第一次成功实现。同时，为了证明PQ-VE反应发生于糖蛋白水平，我们还进行了蛋白质印迹表征，流式细胞术则用于量化SPORT策略的标记效率，二者结果都与预期实验结果相符合。总之，这些结果证明了SPORT实现了对唾液酸聚糖的光控标记。

图2 SPORT实现了对唾液酸聚糖的光控标记

与唾液酸聚糖类似，SPORT同样可以对细胞O-聚糖进行光控标记。我们选用Ac₄GalNAz与1,6pr₂-GalNAz对细胞O-聚糖进行了表征。共聚焦成像、蛋白质印迹及流式结果表明，二者均与SPORT策略兼容。

图3 SPORT实现对细胞O-聚糖的光控标记

接下来，为了证明SPORT策略在不同生物分子上的广泛适用性，我们分别使用Alk-Cho与Aha验证了SPORT策略在脂质与蛋白质水平的可行性。同样使用共聚焦成像与流式细胞术进行表征，结果都表明SPORT成功应用于这两种代谢分子。基于以上结果，我们认为SPORT策略是一种可以广泛应用于各种代谢平台的通用光激活标记方法。

图4 SPORT实现对细胞脂质和蛋白的光控标记

最后，我们探究了利用SPORT策略进行时空分辨标记的可行性。在SPORT策略中，我们选择Alk-Cho与Aha标记细胞，在培养皿中选择大约2mm的区域进行光激活，通过共聚焦成像表征可以发现，光照区域和未光照区域荧光信号有明显差别。此外，我们还将SPORT策略应用在单细胞水平，选择单个细胞的部分区域进行光激活，可以发现，虽然非光照区域有一些非特异性的信号，但是光照区域和未光照区域荧光信号有明显区别。最后，我们还将SPORT策略表征了脉冲追踪实验，研究细胞表面唾液酸聚糖的翻转情况。

图5 SPORT策略进行时空分辨标记的可行性

总之，我们提出了连续光激活生物正交报告标记策略(sequential photoirradiation-orthogonal reporter tagging, SPORT)，该策略可以时空可控地实现活细胞中生物大分子的标记。