分享一篇Angew上的文章Detection of Bacterial Neutral Ceramidase in Diabetic Foot Ulcers with an Optimized Substrate and Chemoenzymatic Probes。通讯作者是新加坡国立大学的李灏教授，她们组主要从事疾病相关的微生物组以及阐明微生物关键酶的研究。
神经酰胺是对皮肤屏障完整性至关重要的一种鞘脂，而神经酰胺酶（CDases）会通过调节神经酰胺组成以及相关下游信号分子来帮助调节皮肤屏障完整性。CDases有中性、酸性、碱性三种类型，他们具有不同的最适pH值和催化机制。目前表皮细胞的CDases功能已被广泛研究，但是尚不清楚一些皮肤驻留微生物细菌的中性CDases发挥的作用。此前仅铜绿假单胞菌的PaCDase被报道通过水解关键的ω-O-acylceramides皮肤屏障密切相关，宿主的脂质会诱导PaCDase表达，PaCDase进一步处理神经酰胺来破坏皮肤屏障完整性；这一结果也说明细菌CDase可能是一种毒力因子，并有可能在如糖尿病足溃疡(DFU)在内的慢性伤口中发挥重要作用。在本文中，作者开发了能够高效检测细菌中性CDases活性的荧光底物，利用它筛选了有效的PaCDase抑制剂，并从抑制剂出发设计衍生探针来检测更复杂细菌样本中的CDases。
作者首先基于商品化CDases底物RBM14C16设计了两个FRET CDase底物，并确定其中的S-B是重组PaCDase的最佳底物；相比之下，人源中性CDases对不同底物的水解速率相似，但PaCDase会优先水解S-B，说明不同来源的蛋白结合底物的口袋存在差别。利用S-B荧光底物，作者从一个93种化合物的库中筛选了PaCDases的抑制剂，并发现了C6-尿素-神经酰胺（C6）能够有效抑制酶活，而此前被报道过针对人源CDases的抑制剂并不会明显抑制PaCDase。在C6的基础上，作者设计了不同的光交联探针，并发现在氨基链上衍生炔基和光交联集团的JX-1有最好的亲和力和抑制活性。在过表达PaCDase的细菌中，JX-1能够有效标记目标蛋白，并被原始抑制剂C6竞争其标记信号。
后续，作者尝试使用JX-1捕捉内源的细菌CDases。在添加鞘氨醇的铜绿假单胞菌培养体系中，作者发现细菌CDases被诱导表达并被分泌到细胞外，且成功被JX-1标记，在诱导8小时左右CDases活性达到峰值。而后作者又培养了一个包括铜绿假单胞菌在内的4种皮肤相关细菌的合成菌群，加入鞘氨醇培养8h后用JX-1标记上清液，发现只有PaCDase被诱导表达并被JX-1标记，证明JX-1能够在复杂环境中特异性标记CDase。最后，作者收集了29名糖尿病足溃疡(DFU)病人在4周内的皮肤伤口拭子样品，培养后用JX-1和S-B检测CDases活性，以此评价细菌CDases和伤口皮肤屏障之间的关系。他们发现6个具有CDases活性的伤口样品的CDases活性强弱与4周内伤口减少面积呈现负相关，暗示细菌CDase可能影响伤口愈合；对这6个样品进行菌落测序后发现铜绿假单胞菌是样品中共同包含的唯一常见菌种，其丰度和CDase活性正相关，后续的JX-1标记实验以及蛋白质组实验也证明了在样品中CDase的存在。总之，本文发展了能够检测细菌中性神经酰胺酶的荧光底物和化学探针，能够用于复杂细菌环境中CDase标记与活性检测。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202307553原文引用：https://doi.org/10.1002/anie.202307553
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