分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.杂志发表题为Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers的研究论文，文章的通讯作者为匹兹堡大学化学系 Alexander Deiters教授。
适体是一种短的单链核酸分子，通过强大的选择策略产生，并以极高的亲和力和特异性与靶标结合它们是多功能的核酸工具，作为生物探针，以及治疗、诊断和药物递送剂有许多应用然而，与核酸酶相比，适体不具有催化活性，而核酸酶已被证明能形成和断开键。核酸适体被开发出能够用功能分子共价标记其蛋白靶标。
本文报道了第一个用可裂解亲电试剂修饰的适体实例，该适体提供了化学基序到蛋白质的转移。该适体作为蛋白质目标的亲和配体，将其共轭亲电试剂带到亲核残基附近，然后通过共价键形成选择性标记转移到蛋白质。在形成共价交联的同时，适体被从亲电试剂中分离出来，然后可以从它的靶标上解离。
首先，如图1，本文通过western blot评估每个适体的处理转移效率(图1a)。重要的是，观察到明显的结构活性关系，因为适体上的亲电位置对其将生物素转移到凝血酶的能力有显著影响，13号位置(编号从5到3)似乎是最有效的。然而，当以较短的1小时潜伏期进行同样的实验时，未检测到标记，这表明弹头可能表现出缓慢的手柄转移动力学。用2修饰的适体与凝血酶在与之前标记反应相同的条件下孵育1小时(图1b)。与亲电试剂1类似，这种弹头显示出明显的，位置依赖的反应性，位置3和7是最有效的，而12和13也显示出一些标记。
图1. 分别用亲电试剂A) 1或B) 2修饰特异性胸苷激酶的适体与凝血酶孵育4 h和1 h, western blot检测生物素化效率。T13和t3修饰的适体分别表现出最有效的标记转移到蛋白质上。标签反应的一般方案显示在底部。通过质谱测序，TBA(3)-2在与凝血酶孵育时，只使19个赖氨酸中的5个生物素化，这进一步支持了这一事实。毫无疑问，根据tba -凝血酶晶体结构，这些赖氨酸位于适配体-蛋白质结合界面(图2a)。定量分析显示，K149、K109-110和K36分别为91%、74%和4%的生物素化，从而证明了柄转移适配体的位点选择性(图2b)。
图2. A) TBA(蓝色)与凝血酶(粉红色)络合的晶体结构。根据质谱测序，放大图像显示T3靠近标记赖氨酸(绿色)，而远离未标记赖氨酸(黄色)。其中一种生物素化赖氨酸K149在晶体结构中缺失。PDB 4 dii。B)生物素化赖氨酸(绿色)和未修饰赖氨酸(红色)的标记率图表。未被质谱覆盖的多肽显示为灰色。生物素化百分比表示凝血酶分子在指示赖氨酸残基上生物素化的比例。接下来，文章研究了共价适配体的蛋白靶选择性，发现凝血酶(300 nM)在过量的牛血清白蛋白(1.5 μM)存在下完全生物素化(图3a)，这种蛋白具有3倍赖氨酸数量。此外，为了评估我们的处理转移适体在凝血酶原生环境中的潜在用途，凝血酶和TBA(3)-2被培养在人血浆中(总蛋白浓度为1.5 mM)，再次观察到高效的靶标标记，而在适体浓度达到500 nM时没有其他蛋白质被生物素化(图3b)。随后的时间过程实验表明，凝血酶的共价修饰不仅有选择性，而且快速。TBA(3)-2在1 μM和0.5 μM时t1/2分别为9.6 min和34 min(图3 C)。
图3 A)在过量BSA (1.5 μM)存在的情况下，凝血酶(300 nM)标记选择性实验。B)人血浆凝血酶(300 nM)选择性实验。TBA(3)-2的浓度分别为0、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。C)凝血酶生物素化时间过程实验。凝血酶浓度维持在300 nM。数据代表平均值，误差条是至少两个独立实验的标准差。
为了展示不同处理的传递的多功能性，并简化标记蛋白的检测，合成了一种二乙基氨基香豆素(desacm)转移亲电试剂3，然后将其偶联到TBA的T3上(图4a)。然后使用荧光共轭物(1 μM)进行凝血酶(300 nM)标记反应(图4B)，desacm选择性地转移到凝血酶上，即使存在过量的牛血清白蛋白(1.5 μM)。此外，当在人血浆中测试时，共价适配体对目标蛋白再次具有选择性，标记的凝血酶很容易通过凝胶荧光成像显示(图4c)。
图4 在变性凝胶上分析荧光柄转移。A) desacm n -酰基磺酰胺亲电结构。B)在过量牛血清白蛋白(1.5 μM)存在的情况下，使用共轭物选择性处理转移到300 nM的凝血酶上，与使用非共轭亲电试剂的非选择性标记相比。C)人血浆中选择性柄转移到凝血酶(300 nM)。TBA(3)-3的浓度分别为0.03、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。
此外，本文将生物素化适体TBA(3)-2与凝血酶浓度降低的PBS (pH值7.4)在37℃下孵育1小时。western blot检测出的检出限为4 nM(图5)。与传统的western blot法相比，这种方法更经济，因为与抗体不同，寡核苷酸可以通过化学合成快速生成，具有均匀性，批与批之间的差异小，货架寿命长。此外，由于生物素-链霉亲和素相互作用的高亲和力，膜潜伏期缩短至1小时，使工作流程更快。
图5 A)比较三种共价适配体介导的凝血酶检测方法，使用0.5 μM的适配体进行荧光和发光检测，或20 nM的射线照相。B)图7中数据(0-15 nM)的放大表示。数据代表平均值，误差条是至少两个独立实验的标准差。综上所述，我们开发了一种能够快速和选择性地标记蛋白质共价的适体;它将生物素和荧光团等功能性基序转移到缓冲液和人血浆中的天然凝血酶上。标记具有完全蛋白质特异性和完全赖氨酸化学选择性。文中涉及的三种化学基型都使一种独特的蛋白质检测方法成为可能，浓度在皮至纳摩尔范围内，使用非常简单的western blot、荧光和射线照相协议。我们期望这里提出的方法广泛适用于现有的和未来的适体，并使这类重要的核酸探针在蛋白质修饰、检测和抑制方面的新应用成为可能。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202101174
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