ACS NANO |用于三光子显微成像的近红外荧光探针

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分享的是一篇2022年发表在ACS NANO上的文章，题目是”Bright Near-Infrared π-Conjugated Oligomer Nanoparticles for Deep-Brain Three-Photon Microscopy Excited at the 1700 nm Window in Vivo”。文章的通讯作者是李盛亮。他们报告了一种设计和合成的荧光分子 ( OFET )，用于在创纪录的成像深度下使用三光子显微镜进行体内小鼠大脑成像。OFET分子具有相对较高的荧光亮度，并在整合为水分散性纳米粒子（OEFT NPs）后在820 nm处具有近红外（NIR）最大发射。在 1720 nm 激发下，OFET NPs 显示出 1.06 × 10 –82 cm 6s 2 /photon2的大的三光子作用截面，是常用的磺基罗丹明101（SR101）染料的2倍以上。得益于在1720 nm 的 NIRⅡ 窗口中的长激发和 820 nm 的NIRⅠ窗口中的发射波长的高组织穿透深度、高亮度和大作用截面的三光子OFET NPs具有良好的深部脑成像性能。

作者首先通过供体 (D) 和受体 (A) 片段的Stille 偶联制备了共轭寡聚体OFET，以构建“D-π-A-π-D”主链，在OFET中，吸电子噻二唑并苯并三唑 (TBZ) 核心和给电子芴通过两个乙烯二氧噻吩 (EDOT) 桥共轭成共轭骨架。如图1所示，在四氢呋喃中测量OFET的UV-vis-NIR 范围内的吸收和光致发光光谱。OFET在 600 nm 处显示出明显的最大吸光度，在 745 nm 处观察到发射信号的最大值，表明在 145 nm 处有较大的斯托克斯位移。溶解在四氢呋喃溶剂中的OFET的绝对量子产率确定为 34%，这明显优于已报道的NIR 显像剂。

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图 1. OFET分子信息及光学表征

由于该OFET分子不溶于水，作者将OFET通过与脂质聚（乙二醇）（DSPE-PEG）的自组装包装为水分散性NP。如图2所示，从动态激光散射 (DLS) 和透射电子显微镜(TEM)可以看出，水分散性OFET NPs 具有代表性的球形圆形，流体动力学直径的平均尺寸为 68 nm。OFET的最大荧光峰NPs自组装成 NPs 后，红移至 820 nm，具有一定程度的荧光猝灭，这主要是由于OFET的 J-聚集体形成所致。OFET NPs水分散体和典型 3PM 探针 sulforhodamine 101 (SR101) 水溶液的荧光强度如图2 F 所示，OFET NPs 在照射30 分钟后显示出相对温和的荧光强度变化，而 SR101 的荧光显着衰减。这证明了OFET NP 的优异光稳定性。癌细胞 A549 和正常细胞NIT-3T3 在与不同浓度的OFET NPs 孵育24 小时后的高活力表明 NPs 具有高度的生物相容性。

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图 2.  OFET NPs光学和生物学表征
该OFET分子具有很强的3PF（三光子）响应。如图3所示，OFET NP 在1720 nm 飞秒激光激发下显示出强 3PF，在 785 nm 处具有最大发射。3PF发射光谱类似于由单光子激发引起的发射光谱。在 3PM 显微镜下，OFET NP 在 1720 nm 的3PM 激发下具有强 NIR 发射，具有良好的 pH 稳定性和光稳定性。此外，在 1720 nm 激发下的 3PM 细胞成像表明OFET NP 能够进入细胞。作者提出了OFET NPs荧光发射的一种可能机制如图3B所示。3PM 激发中的1720 nm 波长几乎是OFET NPs 的单光子激发波长580 nm 的三倍。因此，一个OFET分子可以同时吸收 1720 nm 的三个光子，从而导致785 nm 的三光子荧光发射。

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图 3. OFET NP的3PF表征

作者使用OFET NP对小鼠脑血管系统进行了体内3PM 成像。通过眼眶后注射，用OFET NPs 治疗麻醉小鼠以标记脑血管系统。如图4所示，深度为 1696 μm 的小鼠脑血管系统（黄色）被记录并重建为三维 (3D) 堆栈。为了参考解剖位置，同时获取标记为绿色的三次谐波 (THG) 成像以识别位于大脑表面下850 至 1000 μm 之间的白质层。图4 B-E中的相应 2D 图像显示，可以清楚地分辨低至 1696 μm的血管。OFET NPs成像深度的提高主要得益于近红外荧光和 3PF 在1700 nm 窗口中较大的 ησ 3。以前由 SR101 标记的小鼠脑血管成像通过3PM的成像深度限制为 1340 μm，注射浓度高达5 mM。相比之下，在这里，使用注射浓度仅为 550 μM的OFET NPs 标记，作者以创纪录的深度对体内的脑血管系统进行成像。

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图 4. 3PM重建的小鼠大脑的 3D 成像
3PM相对于 2PM 的一个关键优势是其更好的信背景比 (SBR)。图4 B-E 中沿白线的 SBR如图 4 F-I 所示。随着组织深度从752 增加到 1696 μm，脉管系统的SBR 从 11.3 降低到1.9。理论上，使用 1700 nm 窗口激发，3PM成像的最大理论深度约为 3500 μm。作者认为此处获得的脑成像深度主要受OFET NP 大小和信号损耗的限制。
综上所述，本文设计和合成的小分子可用于 1700 nm 激发下的三光子显微镜成像。自组装成水分散性纳米粒子后，表现出高效荧光（最大发射波长为 820 nm）、1700 nm窗口范围内的大ησ 3以及良好的光学稳定性和生物安全性。并且这些优势能够很好地应用于 3PM 血管系统在体内成像，成像深度可达 1696 μm。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.2c03813



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