分享一篇2022年发表在Angew上的文章，题目是“An Oxazine-Based Fluorogenic Probe with Changeable π-Conjugation to Eliminate False-Positive Interference of Albumin and Its Application to Sensing Aminopeptidase N”。文章的通讯作者为中国科学院化学所马会民研究员和史文副研究员。蛋白酶是一类重要的生命物质，其浓度异常与各种疾病密切相关。例如，氨基肽酶N (APN; 氨基肽酶之一)被认为是与癌症的发生、侵袭、血管生成和迁移有关的生物标志物。因此，对这些酶的敏感性和选择性检测对于诊断和病理生理学研究具有重要意义，荧光成像分析由于其高灵敏度和优越的时空分辨率而被广泛应用。在前期工作中，作者发现许多常见的荧光团或探针，如具有供体-受体结构特征的1,8-萘酰亚胺，尼罗蓝，半花菁及其衍生物，可以非特异性地与白蛋白相互作用。这种相互作用通常通过疏水作用和或分子结构空间构型的限制引起大的荧光增强，从而显示出显著的假阳性干扰。并且，白蛋白在生物系统中普遍存在，且浓度很高，因此其假阳性信号对蛋白酶的准确检测提出了很大的挑战。基于此问题，在这项工作中，作者将白蛋白不敏感的荧光团及其可变的π共轭结构相结合，提出了一个有效的策略来克服这种干扰，并通过设计一个基于噁嗪的氨基肽酶N (APN)的荧光探针来证明这一策略。即，通过在一定条件下可自发断裂的化学键对噁嗪荧光团中的N原子进行丙氨酸修饰，使得得到的探针处于非共轭、无色和非荧光状态，因此白蛋白的非特异性相互作用不产生光谱响应。APN可以选择性地切割丙氨酸部分，恢复大π共轭和使荧光增强。通过对不同细胞系APN的成像，以及对人血清和小鼠尿液中APN的定量测定，证明了该探针具有抗白蛋白干扰的能力。
方案1 探针的常见荧光反应及白蛋白干扰分析。(A) a)不能消除干扰; b)如果白蛋白影响探针的荧光，干扰仍然是不可避免的; c)可以消除干扰，这是本文采用的方法。(B)APN CCS 探针的结构和传感机制。该传感策略结合了白蛋白不敏感荧光团和非荧光(非共轭)探针; 即，白蛋白不敏感荧光团(oxazine 1或亚甲基蓝)的π共轭结构被破坏，因此所得探针(Ox-ala 或 MB-ala)是无色和非荧光的，并且其与白蛋白的相互作用仍然不产生光谱信号。通过体外荧光测试发现在与APN反应后，Ox-ala和MB-ala分别在673和685 nm处发出强荧光，伴随着在约660 nm处出现蓝色(图1)，这符合母体荧光团的特征光谱。这表明APN可以切断探针中相应的丙氨酸底物，从而恢复共轭结构和荧光结构。
图2 A) ，C) UV/Vis 吸收和 B) ，D)在不存在(a)或存在(b) APN (50 ng mL-1)的情况下5 μM Ox-ala (A，B)和 MB-ala (C，D)的荧光发射光谱。插图(A，C)显示颜色的变化。在细胞成像实验中，用探针处理的四种细胞系显示出不同的荧光强度，其中B16和AML-12细胞分别显示出最高和最低的荧光强度。此外，贝他汀氨基肽酶抑制剂对细胞内荧光有明显的抑制作用。假设在这些细胞系中，Ox-ala与APN具有相同的反应性，可以得到细胞中APN含量的大小顺序，即B16 > A549 > HepG2 = AML-12。这一观察结果已通过蛋白印迹分析得到验证(图3C和D)。由于HepG2、A549和B16是癌细胞，而AML-12是正常肝细胞，因此上述结果提示Ox-ala可能通过APN诱导的荧光来识别癌细胞。为了测试这一点，只将AML-12细胞用Hoechst 33342(一种核染料)预染色，然后分别与HepG2，A549和B16细胞共培养，然后进行荧光成像。如图4所示，在用Ox-ala处理的共培养细胞中，HepG2，A549和B16细胞显示比AML-12细胞更强烈的荧光，并且可以通过相应的DIC图像与AML-12细胞区分。
图3 A)不同细胞的共聚焦荧光图像。柱a: 细胞与 Ox-ala (5 μM)温育30分钟; 柱b: 用贝司他汀(100 μM)预处理1小时的细胞，然后与Ox-ala (5μM)温育30分钟。还显示了细胞的DIC图像。B)图 A 中相应荧光图像的相对强度(B16图像 a 的强度定义为1.0)。C)不同细胞中APN的蛋白质印迹分析。以β-微管蛋白作为蛋白质标准品。D) APN与β-微管蛋白的比值。
图4 与 AML-12细胞共培养的 HepG2、A549和B16细胞的共聚焦荧光图像。共培养细胞与Ox-ala (5 μM)孵育30分钟。用Hoechst 33342对AML-12细胞进行预染色。黄色区域表示核为蓝色的AML-12细胞; 红色荧光表示癌细胞。由于近红外特性和良好的识别癌细胞的特性，Ox-ala也尝试在体内成像APN。作者使用HepG2肿瘤小鼠作为模型。如图5A所示，在将探针注射到皮下肿瘤中后，在肿瘤区域中观察到强烈的荧光; 然而，在对照组中，在用贝他汀预处理肿瘤1小时后，然后注射Ox-ala，肿瘤中的荧光被显着抑制，验证肿瘤中产生的荧光来自APN。此外，通过肝内注射HepG2细胞在小鼠体内建立了原位肿瘤。3周后，对肿瘤小鼠的肝脏和脾脏进行牛磺酸染色并成像。如图5B所示，肝脏上的肿瘤和脾脏上的转移性肿瘤显示出显着的荧光(红色箭头指示的区域)，但其他区域显示出更弱的背景荧光。以上结果表明，基于APN成像的Ox-ala可能是一种有用的肿瘤诊断工具。
图5 HepG2肿瘤小鼠体内代表性荧光成像。A)将小鼠肿瘤内注射生理盐水(50 μL; 左)和贝他汀[50 μL，盐水中的200 μM; 右(对照)]1小时，然后用 Ox-ala (25 μL，盐水中的200 μM)。B)肝脏原位肿瘤和脾脏转移瘤的体外显像(左)。器官的亮场图像显示在右边; 肿瘤用红色箭头表示。综上，作者提出了一个有效的策略来克服白蛋白的假阳性干扰。该策略涉及白蛋白不敏感荧光团和CCS探针的联合使用，其中CCS探针以非共轭和非荧光状态固定，以便白蛋白的非特异性相互作用不产生任何显着的光谱响应。此外，作者制备了荧光信号不受白蛋白影响的Ox-ala荧光探针作为APN的体内外成像探针，从而证明了这一原理。该探针能够成像不同细胞中APN的相对水平，定量丰富的白蛋白样品(如人血清)中APN的含量，并在早期检测急性肾损伤小鼠尿液中的APN变化。最重要的是，所提出的策略以及oxazine 1可以很容易地用于开发近红外CCS探针用于其他酶或物质，而不受白蛋白的假阳性干扰。
文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202205043.
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