图 1.基于仿生血红素诱导的 O-O 键断裂的H-FluNox 设计策略和化学结构。(a)四苯甲基卟啉-铁络合物和过苯甲酸衍生物的反应速率作为细胞色素 P450 催化循环的仿生模型。 (b) 促进 LH 诱导的N-氧化物脱氧和 H-FluNox 的化学结构和机理的设计理念。

H-FluNox的反应性和选择性

在谷胱甘肽 (GSH, 100 μM) 存在下使用荧光光谱仪和 HEPES 缓冲液测量H-FluNox 的反应性和荧光响应以模拟细胞内条件。H-FluNox 几乎是无荧光的，而脱氧二氟哌啶-对苯二酚 (DFP-对苯二酚，图1b)的荧光量子产率 (Φ FL= 0.37)。当将血红素（1 μM）添加到探针（0.2 μM）中时，荧光强度很容易增加并在 10 分钟内达到 230 倍（图2a，c），表明与先前报道的内过氧化物相比，H-FluNox 更加敏感。相反，即使在孵育 30 分钟后，添加 Fe(II) 离子 (10 μM) 也导致荧光增加不到 10 倍（图2b，c），这表明探针可以选择性地检测 LH（ 1 μM) 超过 10 倍浓度的 Fe(II)。作者通过比较 H-FluNox 与 Piperidine-FluNox 和 H-RhoNox 的响应，探讨了两个氟原子和荧光团结构对 LH 和 Fe(II) 反应性的影响（图 2d、e）。在孵育 30 分钟后，哌啶-FluNox 的 LH 和 Fe (II) 的荧光强度仅增加了 2 倍（图 2 e）。H-RhoNox 对 LH（80 倍）和 Fe（II）（27 倍）均显示荧光增加（图 2 e）。这些结果表明，二氟哌啶结构和对苯二酚结构对于实现对 LH 的选择性和敏感反应是必不可少的。因此，H-RhoNox 支架对 LH 和 Fe(II) 离子均具有反应性，而 H-FluNox 被 LH 选择性脱氧。向 H-FluNox 添加各种金属离子、活性氧/硫化物/氮物质和生物还原剂不会引发任何荧光增加（图2f）。

图 2. H-FluNox 的荧光响应。（ a ）在谷胱甘肽（GSH，100μM）存在下与血红素（1μM）反应期间H-FluNox（0.2μM）的荧光光谱变化。(b) 在 GSH (100 μM) 存在下与 Fe(II) (10 μM) 反应期间 H-FluNox (0.2 μM) 的荧光光谱变化。(c) 在 GSH (GSH, 100 μM) 存在下添加血红素 (1 μM) 或Fe(II) (10 μM) 后 H-FluNox (0.2 μM) 的荧光强度图）。(d) H-FluNox、Ac-H-FluNox（用于细胞成像）、哌啶-FluNox 和H-RhoNox 的结构。（e）在谷胱甘肽存在下，H-FluNox、哌啶-FluNox 和H-RhoNox（0.2 μM）对血红素（1 μM，黑色条）和 Fe(II)（10 μM）的相对荧光响应（ 100 μm）。(f) 对各种过渡金属离子、碱金属和碱土金属离子的金属选择性测试。

用Ac-H-FluNox检测活细胞中不稳定血红素的变化

受到H-FluNox敏感性和选择性的鼓舞，作者接下来使用 HeLa细胞进行活细胞成像。作者制备了 H-FluNox 的乙酰化前药 Ac-H-FluNox，以通过乙酰基的细胞内水解促进其细胞摄取。在用于细胞成像实验之前，使用水溶性四唑盐 (WST) 测定法测试了 Ac-H-FluNox 和 H-FluNox 的细胞毒性。用于细胞研究的 10 μM 下未观察到细胞毒性，在 100 μM 下观察到超过 75% 的存活率。HeLa 细胞在 37 °C 下用 5-氨基乙酰丙酸 (ALA) (1 mM) 和柠檬酸铁铵 (FAC) (10 μM) 处理 24 小时，促进活细胞中的血红素生物合成（图 3a）。洗涤细胞并用 Ac-H-FluNox (10 μM) 染色 30 分钟，然后进行洗涤和成像。观察到用 ALA+FAC 处理的细胞中的荧光信号显着增加（图3b，c）。LH 水平与 1 mM ALA 孵育 24 小时后达到可检测水平，而用 10 mM ALA 处理导致 LH 在 3 小时出现急性和异常过载。已知琥珀酰丙酮 (SA) 可抑制 ALA 脱水酶，后者在血红素生物合成级联中将 ALA 转化为胆色素原（图 3 a）。用 SA (1 mM) 处理细胞抑制了内源性和外源性诱导的血红素生物合成。因此，与对照相比，在用 SA 和 ALA+FAC 处理的细胞中未检测到荧光信号的显着变化，这表明用 SA（1 mM）处理抑制了由 ALA+FAC 诱导的血红素生物合成的上调（图3 b，c）。此外，在不存在 ALA+FAC 以诱导血红素消耗的情况下，用 SA 处理的细胞显示荧光信号显着降低（图3b，c），表明探针可以检测到内源性 LH 的消耗。作者接下来探索了使用 Zn·PPIX 作为血红素加氧酶 1 (HO-1) 的抑制剂抑制血红素降解后 LH 的积累，HO-1 催化血红素降解。用 Zn·PPIX (2 μM) 和 ALA+FAC (1 mM + 10 μM)处理 HeLa 细胞以诱导 LH 的过度积累。作者观察到 Zn·PPIX 对血红素加氧酶的抑制提供了 ALA-FAC 处理细胞中荧光信号的额外增强（图 3 d，e）。这些数据验证了 Ac-H-FluNox 的性能，它可以选择性地检测细胞内 LH 水平及其外源性诱导的升高和消耗。

图 3. 补充 5-氨基乙酰丙酸 (ALA) + 柠檬酸铁铵 (FAC)、琥珀酰丙酮 (SA) 和锌原卟啉 IX 诱导的活 HeLa 细胞中不稳定血红素 (LH) 池的 Ac-H-FluNox 成像 (锌·PPIX)。(a) 血红素的代谢方案和抑制剂的作用模式。(b) 用 ALA (1 mM) 和 FAC ( 10 μM) 在存在或不存在 SA (1 mM) 的情况下 24 小时，然后洗涤并在 HBSS 中用 Ac-H-FluNox (10 μM) 染色 30 分钟，然后洗涤和成像。(c) 为实验 (b) 中获得的图像量化的平均荧光强度。每个条形显示平均值 ± sem ( n= 3)。(d) 在存在或不存在锌原卟啉 IX (Zn·PPIX, 2 μM) 的情况下，用 ALA (1 mM) 和 FAC (10 μM) 预处理的 HeLa 细胞的共聚焦荧光显微图像（上）和 DIC 图像（下）洗涤前 12 小时，在 HBSS 中用 Ac-H-FluNox (10 μM) 染色 30 min，然后洗涤和成像。(e) 为实验 (d) 中获得的图像量化的平均荧光强度。

NO诱导LH瞬态释放的检测

LH波动与血红素诱导的亚细胞信号传导广泛相关。作者探索了我们的探针是否可以通过利用 Reddi 等人建立的一氧化氮 (NO) 诱导的急性血红素释放模型来监测内源性LH水平的瞬时波动。NO供体的补充通过硫醇的亚硝基化瞬时启动内源性血红蛋白释放 LH。HeLa 细胞用 NO 供体 NOC-5（t 1/2 = 25 分钟）处理 20 分钟，然后用探针染色 30 分钟，细胞保持在 NOC-5 处理的条件下。由于 H-FluNox 是一种不可逆的基于活性的探针，需要 30 分钟的染色时间，因此应注意荧光信号应反映从添加探针到随后 30 分钟的亚细胞 LH 水平的综合变化。NOC-5 处理的细胞的荧光强度以剂量依赖性方式增加（图4a ，b）。

图 4. 活 HeLa 细胞中 NO 诱导的 LH 释放的荧光成像。(a) 在用 Ac-H-FluNox (10 μM) 染色前，用 NOC-5（NO 供体，0、50 和 100 μM）处理 20 分钟的 HeLa 细胞的共聚焦荧光显微图像（上）和 DIC 图像（下） ) 30 分钟，将细胞保持在 NOC-5 处理条件下，然后进行洗涤和成像。比例尺表示 50 μm。（b）为实验（a）中获得的图像量化的平均荧光强度。每个条形图显示平均值 ± sem ( n = 3)。

铁死亡期间 LH 升高的可视化

由于血红素是一种参与氧化应激的亲脂性氧化还原活性物质，过量的 LH可能会诱导脂质过氧化。积累的脂质过氧化物引发铁死亡中的细胞死亡，这是由 Fe(II) 介导的脂质氧化引起的。因此，作者利用探针来确定铁死亡期间亚细胞 LH 水平是否发生了改变。作者选择 SiRhoNox-1 作为包含不稳定 Fe(II) 离子和 LH的总不稳定 Fe(II) 物种的荧光指示剂，因为它对 Fe(II) 离子和 LH的响应性相当，成功的不稳定 Fe( II）在先前研究中进行的铁死亡期间的检测。正如我们之前报道的，在erastin 处理的细胞的深红色通道（SiRhoNox-1）中观察到显着的荧光增加，去铁胺(DFO, 100 μM) 共同处理抑制了这种情况（图 7 a，b），表明可被 DFO 螯合的不稳定Fe(II) 离子的水平在铁死亡时升高。相比之下，在绿色通道(H-FluNox) 中，erastin 处理引起了不受 DFO 影响的显着荧光增强（图 7a，c），表明LH水平在铁死亡期间也增加。在erastin处理之前补充SA不影响铁死亡，而DFO使细胞免于铁死亡（图 7d）。作者观察到用SA预处理部分抑制了erastin诱导的LH水平上调。因此，可以推测，在铁死亡期间升高的 LH 大部分来自血红素的内源性来源，而不是来自新合成的血红素。

图 7. ferroptosis 期间 LH 动员的荧光成像。(a) 用erastin（ferroptosis 诱导剂，10 μM）预处理的 HT1080 细胞的深红色（SiRhoNox-1，品红色，上）、绿色通道（H-FluNox，黄色，中）和 DIC 图像（下）的共聚焦荧光显微图像) 在存在或不存在去铁胺 (DFO, 100 μM) 的情况下 6 小时，然后用 HBSS 中的 Ac-H-FluNox (10 μM) 和 SiRhoNox-1 (5 μM) 染色 30 分钟，然后洗涤和成像。(b) 为 (a) 中获得的 SiRhoNox-1 图像量化的平均荧光强度。每个条形图显示平均值 ± sem ( n = 3)。(c) 为 (a) 中获得的 H-FluNox 图像量化的平均荧光强度。每个条形图显示平均值 ± sem ( n = 3)。使用学生t检验进行统计分析。（ d ）在不存在（空心方块）和存在DFO（100μM，实心黑色圆圈）的情况下用erastin处理24小时的HT1080细胞的细胞活力。

综上所述，该文章为探索细胞如何控制亚细胞血红素水平和分布提供了一个设计思路，并将对包括病理学、生理学、植物生物学和细菌学在内的广泛研究领域作出潜在贡献。