分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.杂志发表题为Coupling Aptamer-based Protein Tagging with Metabolic Glycan Labeling for In Situ Visualization and Biological Function Study of Exosomal Protein-Specific Glycosylation的研究论文，文章的通讯作者为厦门大学杨朝勇教授。外泌体被糖蛋白大量覆盖，参与许多关键的生理和病理过程，如信号传递、免疫抑制、和肿瘤转移。外泌体蛋白的糖基化定义了蛋白质的生物学功能，从而决定了外泌体在细胞间通讯中的信号传导特性。因此，外泌体蛋白糖基化的表征对于进一步了解外泌体的生物学意义非常重要。已经报道了几种用于研究外泌体特异性蛋白糖基化的策略，例如凝集素测定和质谱。这些策略具有破坏性，因为它们需要从外泌体释放靶蛋白，因此与生理状态下的外泌体糖蛋白的生物学研究不相容。因此，仍然非常需要制定有效的策略来识别和探索外泌体蛋白特异性糖基化的生物学意义。为了表征外泌体蛋白的糖基化并探索其生物学功能，本文开发了一种基于蛋白质特异性适体标记和唾液酸代谢聚糖标记 (ExoAp-MGL) 的双标记策略，用于原位可视化外泌体蛋白特异性糖基化。选择外泌体程序性细胞死亡配体1（exoPD-L1）的糖基化作为靶模型，因为exoPD-L1是高度N-糖基化的，并且在调节免疫逃逸中起重要作用。不幸的是，exoPD-L1 糖基化的功能仍不清楚，限制了对免疫抑制机制的整体理解，也阻碍了 exoPD-L1 在免疫治疗中的诊断和治疗应用。首先，如图1，本文研究了代谢糖标记（MGL）后外泌体的完整性。如图1 A，B，代谢标记的外泌体具有经典的杯形，平均尺寸为 134 nm。抗体染色结果表明，标准外泌体和代谢标记外泌体的分子量，经典外泌体标志物 CD63和免疫检查点 PD-L1 的表达水平相似（图1 C，D）。与对照蛋白或 DNA 序列相比，PD-L1 抗体或 PD-L1 适体对代谢标记的外泌体的荧光增量与标准外泌体的荧光增量大致相似（图 1 E），表明 MGL 不影响识别 PD-L1 抗体或 PD-L1 适体。PD-L1适体不影响exoPD-L1和PD-1之间的自然相互作用（图 1 F）。
图1 代谢标记的 A375 外泌体的鉴定和 PD-L1 识别分子（适配体和抗体）的结合特性的表征。A) 代谢标记的外泌体的透射电子显微镜 (TEM) 图像。B) 通过纳米粒子跟踪分析 (NTA) 对代谢标记的外泌体进行大小统计。C) CD63 抗体和 PD-L1 抗体对标准和代谢标记的外泌体的抗体染色性能。D)蛋白质印迹分析PD-L1在代谢标记的外泌体上的表达水平和去糖基化。E) PD-L1抗体与PD-L1适体结合性能的流式细胞术分析。F) PD-L1适体对exoPD-L1和PD-1相互作用的影响。
为了可视化 exoPD-L1糖基化，使用烷基染料 (DBCO-Cy5) 与 MGL 引入的外泌体叠氮化物唾液酸进行生物正交反应（图 2A ）。与代谢标记的外泌体生物正交结合的DBCO-Cy5的荧光强度是标准外泌体的3.3倍，表明DBCO和叠氮化物唾液酸在外泌体上的生物正交反应成功（图2 B ）。然后，研究了 exoPD-L1 糖基化用于原位可视化 Cy3 标记的 PD-L1 适体和 DBCO-Cy5 之间的 FRET 信号的可行性。如图2C所示 ，在用 DBCO-Cy5 和 PD-L1 适配体-Cy3 染色的 A375 外泌体上观察到明显的 FRET 信号，而单独染色都没有 FRET 信号。这些结果不仅验证了ExoAp-MGL策略的有效性，而且首次为exoPD-L1原位糖基化提供了直接、可视化的证据。
图2 exoPD-L1 糖基化的可视化。A) 外泌体叠氮化物唾液酸和炔基 DBCO-Cy5 之间的生物正交反应方案。B) 用或不用 Ac 4 ManNAz的 A375 处理衍生的外泌体的荧光强度，然后用 DBCO-Cy5 孵育。C) 乳胶珠与代谢标记的外泌体与 PD-L1 适体-Cy3 和 DBCO-Cy5 孵育的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 成像。
接下来，应用 ExoAp-MGL 策略探索糖基化 exoPD-L1/PD-1 和去糖基化 exoPD-L1/PD-1 的相互作用特性。代谢标记的 g-外泌体和 dg-外泌体依次用 DBCO-Cy5 和 PD-L1 适体-Cy3 标记，然后与 PD-1 受体孵育，随后进行 CLSM 原位成像（图 3A）。PNGase F处理后DBCO-Cy5和FRET信号的荧光强度明显降低（图 3B），表明exoPD-L1的糖基化水平降低。此外，PD-1 报告基因与外泌体的结合也随着糖基化的去除而降低。FRET 信号的荧光强度与 PD-1 染色信号的荧光强度相关，Pearson 相关系数为 0.80（图 图3 C )，显示 exoPD-L1 糖基化和 PD-1 结合之间的强正相关。ExoAp-MGL策略首次获得的这一结果表明exoPD-L1糖基化是exoPD-L1与PD-1相互作用的关键结构基础。
图3 exoPD-L1 糖基化对与 PD-1 相互作用的影响。A) 乳胶珠与代谢标记的 dg-外泌体或与 PD-L1 适体-Cy3、DBCO-Cy5 和 PD-1-PE 一起孵育的 g-外泌体的 CLSM 成像。B）PD-L1适配体-Cy3、DBCO-Cy5 和乳胶珠与代谢标记的 dg-外泌体（n = 22）和乳胶珠偶联的 FRET 信号的定量 CLSM 强度与代谢标记的g-外泌体（n = 23）。C）Pearson相关性检验FRET信号与PD-1染色信号荧光强度的Pearson相关性分析（R =0.80，P <0.0001，n =45）。为了进一步研究 exoPD-L1 糖基化在免疫抑制中的作用，建立了 exoPD-L1 和 CD8 + T 细胞的相互作用，已被报道为 exoPD-L1 介导的免疫抑制模型。通过 ExoAp-MGL 策略可视化代谢标记的g-外泌体/dg-外泌体和 CD8 + T 细胞之间的相互作用（图4A）。用FRET信号明显观察到g-外泌体与CD8 + T细胞的结合，而在CD8 + T细胞表面几乎没有发现dg-外泌体（图 4A）。这些结果明确表明 exoPD-L1 糖基化有助于识别 PD-1 阳性 CD8 +T细胞。对于两种外泌体治疗，分裂的 CD8 + T 细胞的数量随着外泌体剂量的增加而减少（图 4B）。然而，用 dg-exosomes 处理的分裂 CD8 + T 细胞的数量约为 g-exosomes 的两倍，这表明 exoPD-L1 的糖基化可能有助于抑制 CD8 +的增殖T细胞。
图4 exoPD-L1糖基化对CD8 + T细胞识别和抑制的影响。A) CD8 + T 细胞上代谢标记的 g-外泌体/dg-外泌体结合的 CLSM 成像。B)不同浓度的代谢标记的g-外泌体/dg-外泌体处理中分裂CD8 + T细胞数量的相对变化。综上所述，作者提出了一种新的 ExoAp-MGL 策略，用于基于适体识别和代谢聚糖标记的外泌体蛋白原位糖基化的鉴定和功能研究。通过ExoAp-MGL策略，首次证明exoPD-L1的糖基化是exoPD-L1/PD-1相互作用和抑制CD8+ T细胞增殖的结构基础。因此，exoPD-L1的糖基化不仅在免疫抑制中起重要作用，而且可能作为新的免疫治疗靶点。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202103696
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