分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.杂志发表题为Neutrophil-Selective Fluorescent Probe Developmentthrough Metabolism-Oriented Live-Cell Distinction的研究论文，文章的通讯作者为韩国浦项科技大学Young-Tae Chang教授。

血液由多种成分组成，白细胞占血细胞的比例不到 1%。尽管细胞数量较少，但它们是免疫系统的重要组成部分，通过攻击侵入人体的细菌和病毒来帮助抵抗感染。白细胞被确定为三个主要类别，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，它们的功能和相互作用控制着免疫反应。中性粒细胞是一种粒细胞，是人体血液中最丰富的免疫细胞。在人类血液样本中，白细胞可通过前向与侧向散射门控区分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。然而，很难区分大小和粒度相似的不同细胞类型。为了克服这一限制，利用以分化簇 (CD) 命名的细胞表面抗原的特定组成来准确定义不同的细胞类型。然而，如果不同的细胞类型共享相同的 CD 标记，则多种抗体组合对于准确识别一种细胞类型至关重要。例如，人类中性粒细胞的分类基于细胞表面标志物 CD11b、CD15、CD16、CD66b 和 CD33 以及细胞质标志物髓过氧化物酶的表达。通常，至少使用两种抗标志物组合来鉴定人类中性粒细胞，这使得该技术更加复杂、耗时且成本高昂。

化学探针有机会克服这些缺点，为区分和监测活细胞类型提供更多机会。通过一种荧光探针而不是几种抗体的组合实现细胞识别。这项研究通过面向多样性的荧光库方法（DOFLA）的无偏筛选报告了第一个用于活人中性粒细胞的荧光探针，并阐明了选择性作为代谢导向的活细胞区别的分子机制。

首先，如图1，选择来自健康供体的人外周血作为 WBC 来源。在 RBC 裂解后，获得 WBC 并将其铺板到荧光文库中。然后流式细胞仪用于无偏的高通量筛选(图1 a)。在流式细胞仪中，人类血液的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞可以通过前向与侧向散射门控简单区分（图1 b）。随后，通过荧光通道与SSC门控，将荧光强度的偏移值作为筛选标准。可以选择细胞荧光强度的高级亮移作为靶细胞，然后用抗体确认以识别靶细胞类型。在 CD 标记鉴定中，LFB-H7 对中性粒细胞的特异性通过与中性粒细胞标记 CD16 共染色得到证实；LFB-H7 明亮群体与抗 CD16+ 细胞相匹配（图 1c)。最后，LFB-H7 被鉴定为绿色中性粒细胞选择性探针，并被赋予新名称NeutropG ( Neutrop hil G reen)。

图1 通过DOFLA法无偏筛选荧光探针。a) 开发用于人类嗜中性粒细胞的荧光探针和NeutropG化学结构的工作流程。b) 流式细胞仪显示红细胞裂解后NeutropG在人血中的表现。c)在门控粒细胞上用NeutropG（左）单染色和用抗 CD16 和NeutropG （右）双染色的流式细胞仪散点图图像。d) NeutropG对全血中中性粒细胞的选择性

接下来，粒细胞由具有相似大小和复杂性的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成，这使得在 FSC 与 SSC 散点图中很难相互定义。为了进一步证实NeutropG 的选择性，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞通过使用抗体的负 MACS（磁激活细胞分选）选择进行纯化（图 2a）。分离这三种细胞类型后，将NeutropG直接添加到细胞中并孵育 1 小时。清楚地表明，NeutropG在流式细胞术和荧光图像中对中性粒细胞具有显着的特异性（图 2b）。在亚细胞水平，NeutropG定位在中性粒细胞的脂滴中，这通过与商业脂滴染料尼罗红共染色得到证实（图 2c）。

图2  NeutropG在人中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中的选择性和定位。a) 用于快速富集靶细胞的阴性选择。b)人中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中NeutropG的流式细胞术直方图。c) 荧光图像显示分别用NeutropG (0.2 μM)、尼罗红 (1 nM) 和 Hoechst (1 μg mL ^-1 ) 处理 1 h、30 min 和 10 min后中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的细胞内荧光强度.

接下来，染色动力学研究发现，NeutropG从内质网到脂滴的荧光信号位置变化与已知的脂滴生物发生相匹配。作者假设中性粒细胞脂滴生物发生过程中高表达的关键基因ACSL1 和 DGAT2可能对NeutropG的选择性起关键作用（图3 b）。使用ACSL1 和 DGAT2两种酶的抑制剂作用于中性粒细胞，通过通过流式细胞术评估NeutropG的摄取，发现Triacsin C（ACSL 抑制剂）和 Amidepsin D（DGAT 抑制剂）在中性粒细胞中显示出对NeutropG摄取的显着抑制作用（图 3c）。因此作者认为，NeutropG在中性粒细胞中的选择性是由 ACSL1 和 DGAT2 的代谢酶驱动的。由于这两种酶与脂滴生物发生有关，因此NeutropG的染色机制是细胞代谢依赖性的，并命名为代谢导向的活细胞区分 (MOLD)。

图3  NeutropG的目标识别机制。a) 提出的NeutropG染色机制。b) 粒细胞和 PBMC 中 CD36、ACSL 和 DGAT 基因的 RNA-Seq 转录组分析热图。c) Triacsin C 和 Amidepsin D 在RBC 裂解后使用人血通过流式细胞术对NeutropG摄取的影响。d) SSO、Triacsin C 和 Amidepsin D 对使用分离的中性粒细胞摄取NeutropG的影响。

最后，作者研究了这种荧光标记方法是否可用于追踪中性粒细胞追逐和吞噬细菌。首先，在将NeutropG添加到中性粒细胞后，在延时显微镜下观察标记过程。为了监测吞噬过程，细菌（大肠杆菌、大肠杆菌）用 DAPI 标记，中性粒细胞用NeutropG和细胞膜染料（Cellmask Deep Red）共同染色。以 10 秒的间隔拍摄图像。延时成像显示，NeutropG标记的中性粒细胞注意到大肠杆菌，然后密切追赶并最终在 180 秒时吞噬细菌，证明中性粒细胞具有典型的趋化和抗微生物功能（图 5a）。为了清楚地确定吞噬细菌在嗜中性粒细胞中的位置，进行了 Z 堆叠成像（图 5b）。Z-stack 成像显示了中性粒细胞内的细菌分布。正交视图和来自z堆叠的重建 3D 模型可以更好地识别细菌位置（图5 c,d）。同时，与临床现有方法相比，NeutropG与医院结果之间存在线性相关，具有高决定系数。由于绝对斜率接近 1，因此也验证了细胞计数的高精度（图5 e）。

综上所述，作者提出了第一个小分子荧光探针NeutropG，用于通过高通量筛选和生化分析对活的中性粒细胞进行鉴定和成像。NeutropG对中性粒细胞的选择性高于其他血细胞类型。NeutropG定位在脂滴中，并有望作为脂滴生物发生的底物。他们将这种细胞选择性的新概念创造为代谢相关染色的代谢导向活细胞区分 (MOLD)这种使用NeutropG的快速、稳定、免洗和生物相容性荧光标记方法已成功证明可在吞噬过程中监测嗜中性粒细胞寻找大肠杆菌。最后，NeutropG应用于临床血液样本，显示出与当前临床方法的良好相关性，强调其作为临床诊断工具的巨大潜力，尤其是代谢活跃的中性粒细胞。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202108536