Angew | 使用优化的底物和化学酶探针检测糖尿病足溃疡中的细菌中性神经酰胺酶

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给大家介绍一篇来自“Angewandte Chemie International Edition”的文章,题名为“Detection of Bacterial Neutral Ceramidase in Diabetic Foot Ulcers with an Optimized Substrate and Chemoenzymatic Probes”。

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神经酰胺酶(CDase)通过调节神经酰胺成分和提供下游信号分子来控制皮肤屏障的完整性。虽然表皮CDase的功能是已知的,但皮肤微生物分泌的中性CDase的作用尚不明确。在这里,作者开发了一种一步式荧光底物S-B,用于特异性检测细菌CDase活性和抑制剂筛选。最终研究发现,细菌CDase是皮肤神经酰胺的重要调节因子,并可能在伤口愈合中发挥作用。

为了方便、实时地测定CDase酶动力学,作者首先设计并合成了两种一步荧光共振能量转移CDase底物(图1A)。作者观察到重组铜绿假单胞菌神经酰胺酶(rPaCDase) 在 30 min ( S-A ) 和 20 min ( S-B )内水解两种底物(图1B),其中S-B是最佳底物(图 1D)。为了比较皮肤相关细菌中性神经酰胺酶与人 nCDase 的酶活性,作者还重组表达了来自两种常见皮肤共生菌棒状杆菌 (rCaCDase) 和棒状杆菌 (rCjCDase ) 的nCDase 。rPaCDase 对S-B的优先水解表明细菌和人中性神经酰胺酶的底物结合口袋存在重要差异。

随后作者着手鉴定细菌 CDase 抑制剂,发现最有效的化合物是底物模拟物 C6-脲-神经酰胺 ( C6 )。

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图1

随着C6被确定为 rPaCDase 的有效抑制剂,作者进一步修改了该化合物以生成用于 CDase 分析的可点击化学酶探针。5 个 AfBP(JX-1-5,图 2A)的设计是将二氮丙啶和炔安装在两个烷基链(鞘氨醇链和氨基链)的不同位置,因为光反应基团的位置会影响标记效率和特异性。作者首先通过确定针对 rPaCDase 活性的 IC50来评估它们的结合亲和力(图 2B)。然后作者评估了最有效的探针JX-1标记细菌 CDase的能力。结果表明,JX-1在CDase 探针小组中,展示了最高的探针标记效率和酶选择性。

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图2

接下来作者研究了优化的化学酶探针JX-1是否可用于检测天然分泌的细菌 CDase(图3)。总体而言,优化的底物和探针都是检测和定量复杂蛋白质混合物中低丰度天然胞嘧啶脱氨酶的简便化学工具。此外,作者评估探针是否可以检测复杂微生物群落中存在的CDase,结果表明皮肤微生物 CDase 作为糖尿病伤口感染毒力因子的潜在作用。

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图3

总之,作者设计并合成了一步细菌CDase底物,用于快速检测和筛选CDase抑制剂,还设计并合成出了第一个基于亲和力的 CDase 探针。优化的化学酶探针JX-1能够在复杂的微生物群落中标记、鉴定和定量细菌CDase。作者的研究强调了考虑人类皮肤上微生物产生的细菌 CDase 的作用以及这些酶如何改变它们所处环境的重要性。



本文作者:QHJ

责任编辑:FC

DOI: 10.1002/anie.202307553

原文链接:https://doi.org/10.1002/ani.202307553


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