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分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Antigen-Specific T Cell Detection via Photocatalytic Proximity Cell Labeling (PhoXCELL)”。本文报告了一种通过光催化近距离细胞标记(PhoXCELL)来检测和定量细胞间相互作用的时空分辨方法。生物相容光敏剂二溴荧光素(DBF)被利用和优化，作为一种非遗传选择的酶促方法，在细胞表面的光照射(520 nm)下高效生成单线态氧，这允许随后使用主要的脂肪胺探针标记附近的氧化蛋白。他们证明DBF功能化的树突状细胞(DCs)可以通过快速光照射，定量区分相互作用强度，在免疫突触中标记相互作用的T细胞，这揭示了T细胞与抗原脉冲树突状细胞强相互作用的独特基因特征。此外，我们利用PhoXCELL同时检测小鼠肿瘤模型中肿瘤浸润淋巴细胞和引流淋巴结中的肿瘤抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，使PhoXCELL成为一个强大的平台，以识别T细胞受体(TCR)相关的个人免疫治疗中的抗原特异性T细胞。
虽然近距离标记策略已被开发用于捕捉生活环境中的T细胞-免疫细胞相互作用，但目前的方法在很大程度上受到了酶缀合物的复杂合成或小鼠基因工程的限制。此外，缺乏时空控制进一步使这些方法难以准确捕捉初级组织样本中的短暂或特异性T细胞相互作用。同时，大多数这些方法不能提供精确和完整的分离相邻细胞的唯一分子签名。为了满足对抗原特异性T细胞的时空和定量检测的迫切需求，他们设想具有上述远程和时间控制能力的光催化平台是非常理想的。因此他们报告了一种用于抗原特异性T细胞检测的光催化接近细胞标记(PhoXCELL)策略，该策略提供了一种非酶的、单重氧介导的抗原特异性T细胞接近标记方法。 图1通过PhoXCELL检测抗原特异性T细胞
在有机光敏剂中，DBF因其优良的生物相容性，是广泛用于生物样品接近标记的探针之一。它已被应用于RNA和RNAbindn蛋白质分析、蛋白质组学研究以及Click-EM，使其成为一种很有前途的细胞表面标记光催化剂。他们之前已经进化出一种单甘氨酸识别分选酶A(mgSrtA)，用于多种细胞类型的细胞表面标记，使用这种非遗传策略将DBF引入所需的细胞表面。设计并合成了一种LPETGG偶联的DBF光催化剂作为mgSrtA的底物，它可以将LPETGG偶联的底物标记到蛋白质n端单甘氨酸残基上。DBF-LPETGG被成功地引入了细胞表面，包括原代骨髓源性树突状细胞(BMDC)(图2a)。荧光成像和流式细胞术(FC)分析清楚地显示，DBF可以有效地偶联在细胞表面(图2b)。接下来，我们系统地优化了DBF标记细胞表面的光催化标记反应，因为辐照波长和标记探针在以前的应用中存在显著差异。因此选择三个波长的光，测试各种亲核生物素探针光氧化后的标记能力，包括伯脂胺、醇、硫醇、芳香酚、苯胺、萘胺(图2c)。当使用DBF修饰的BMDC作为模型细胞时，生物素醇(BAl)在所有三个波长下都没有标记信号，而生物素硫醇(BMe)、生物素酚(BP)、生物素苯胺(BAn)和生物素萘胺(BNap)有更高水平的背景标记，定义为光照射下产生的标记信号(图2d−f)。通过共聚焦成像对DBF的光催化接近标记进行了表征，证明了在细胞膜上具有清晰标记信号的空间分辨率(图2g)。
图2 PhoXCELL作为邻近细胞标记的非遗传策略的开发和验证 接下来他们通过PhoXCELL接近标记抗原特异性T细胞。在验证了DBF作为一种可靠的细胞表面标记光催化剂后，他们使用抗原特异性树突状细胞和OT-I T细胞之间的相互作用作为他们的模型来表征这种细胞间标记的光催化系统。为了在这个模型中证明PhoXCELL，将DBF修饰的未成熟树突状细胞)与OT-I T细胞共培养，然后在光照射下进行PhoXCELL介导的生物素化(图3a)。通过流式细胞术分析，生物素信号可以在猎物OT-I T细胞上特异性和有效地检测到（43%），而不相关的抗原引物或未引物IDCs仅诱导了背景标记（1−4%）(图3b，c).这些结果证实了接近标记可以识别独立于功能标记CD69的相互作用的抗原特异性T细胞。 脉冲追逐法经常被用来表征光催化系统的时间控制。我们描述了PhoXCELL在细胞表面的这种能力，并证明了单线态氧诱导的细胞标记可以通过光照射快速开启/关闭(图3d)。为了检测相互作用细胞上的标记区域，我们对PhoXCELL后的体外DC−T细胞簇进行了共聚焦成像实验，观察到相互作用突触中显著的生物素信号(图3e)。
图3 PhoXCELL能够在体外时空捕获抗原特异性T细胞
最后他们进行了小鼠肿瘤模型中抗原特异性T细胞的体外检测。在他们的工作流程中，一个收获的皮下实体肿瘤被消化成单细胞悬液，通过密度梯度离心分离后，从肿瘤细胞中富集肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。从肿瘤裂解液中提取的TSAs被用于启动作为诱饵细胞的自体iDC。通过酶解和树突状细胞的呈递，非突变肽和TSA相关表位都被装载到iDC表面的MHC上。在共培养时，引物iDCs可以识别并与TSA反应性T细胞相互作用，这促使我们假设TSAre活性T细胞可能通过我们基于PhoXCELLl的抗原特异性T细胞捕获策略进行生物素标记和富集(图4a)。TSA引物的DBF-iDCs不仅捕获了自体CD8+TILs（35.9%），而且同时检测到了具有相似标记率的CD4+TILs（29.1%）(图4b，c)。他们进一步进行干扰素(IFN)-γ酶联免疫点（伊利斯特）检测，以评估PhoXCELL鉴定的抗原特异性T细胞的TSA反应性。当用肿瘤裂解物启动的iDCs重新刺激时，在Bio−和Bio+组中，从未启动的DBF-iDCs标记的CD8+TILs中只能检测到IFN-γ的分泌(图4e，g)。此外，在CD4+TILs中观察到相同的结果，IFN-γ分泌仅在肿瘤溶解的DBF-iDCs标记的Bio+TILs中变得显著(图4f，g)。最后，在他们的结果中，他们发现所有生物素化的CD8+TILs都是PD-1+和CD39+(图4h)，这与之前报道的PD-1和CD39是CD8+TILs中表达的潜在新抗原特异性标记物一致。这些结果共同证实了真正的CD8+和CD4+ TSA反应性T细胞可以同时被PhoXCELL捕获和富集。 图4 通过PhoXCELL检测体外TSA反应性T细胞 总之，本文证明了一种光催化剂支持的细胞间标记策略来识别处于接近自然状态的抗原特异性T细胞。与接近标记酶相比，探针DBF-LPETGG更稳定，更容易合成，这使得PhoXCELL成为一个捕获细胞−细胞相互作用的可靠和直接的系统。此外，光诱导的、单线态氧介导的接近标记特征使PhoXCELL成为一种时空可控的工具，可以快速、精确地生物素化免疫突触内相互作用的细胞。 本文作者：FC 责任编辑：FC DOI: 10.1021/jacs.2c00159 原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c00159
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