分享一篇2022年发表在Angew. Chem.上的文章，题目是“ A Kinetic and Fluorogenic Enhancement Strategy for Labeling of NucleicAcids ”。文章的通讯作者为加拿大麦吉尔大学化学系Nathan William Luedtke教授。

生物分子的化学选择性修饰反应为生物和生物医学研究提供了不可或缺的工具。其中，化学生物学领域的生物正交标记反应在序列识别、病毒感染敏感检测、蛋白交联、代谢途径阐明、耐药敏感机制等方面已取得成功。这种生物正交法最初是为蛋白质或碳水化合物设计的，后来应用于核酸。这些反应包括铜催化或张力促进的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC or SPAAC)，烯烃与四氮化合物之间的逆电子按需Diels-Alder(IEDDA)反应，以及四氮化合物的1,3偶极光点击反应。尽管在体外取得了这样的进展，但体内核酸标记的例子仍然很少，要么局限于单链RNA，要么依赖于膜透性和/或光毒性方法来实现天然染色质中紧密包裹的双链DNA的高效反应。此外，先前报道的细胞核酸的四嗪-烯烃生物正交反应太慢(0.02-0.42 M^-1 s^-1)，无法在活细胞中可视化高度动态的过程。

基于此问题，Nathan William Luedtk课题组报道了一种针对核苷烯烃基团的成像探针—“PINK”，它包含一个二甲胺基吖啶荧光团和四嗪结构，四嗪既是生物正交官能基，也是荧光猝灭剂。PINK本质上是不发光，它对双链DNA进行可逆的插入扫描，直到它遇到乙烯基修饰的核苷酸，它会经历一个非常快速的荧光IEDDA反应

首先，如图1，作者以苯胺1为起始原料，与溴化芳基2进行了Buchwald-Hartwig交叉偶联反应，所得仲胺与轻度lewis -酸性硅胶接触后自发环化，得到了64%的分离收率的新吖啶腈3。不对称甲基四嗪的后续安装是通过与肼、Zn(II)和乙腈反应，然后与NaNO2氧化得到总收率为18%的红色固体PINK(4)。

图1 PINK的合成路线以及标记反应

接下来，为了评估PINK(4)在双链DNA中可逆插入的能力，作者监测了加入小牛胸腺(CT) DNA后PINK的吸光度。在加入CT DNA后，观察到PINK吸光度的红移(图1a)，表明PINK成功插入。为了进一步评估结合模式，作者对浓度梯度的DNA溶液进行了粘度测量。根据Lerman对DNA插层剂的假设，PINK使溶液的粘度(η)增加，并显示出PINK与DNA碱基对的化学比为1:5(图1b)。使用这种化学计量学和滴定法，利用PINK的吸光度随DNA浓度的增加而变化，作者估计了表观解离常数(KD) = 5.1 ± 1.0 μM。这种DNA亲和力与其他吖啶类衍生物相似，表明PINK的四嗪部分不干扰DNA结合。在反应过程中，观察到荧光增加约100倍(图1c)。而PINK-VdU反应产物(6)的φF = 3.5 19%，这取决于所使用的溶剂(图1d)。高粘性溶剂，包括甘油和聚乙二醇(PEG 200)诱导了（6）更高的荧光，这可能是通过限制键旋转，从而抑制非发射的、扭曲的分子内电荷转移(TICT)状态的形成。

图2  PINK的光物理和DNA结合特性。

接下来，为了评估PINK进入活细胞并与染色质乙烯基集团的反应能力，海拉细胞在终浓度为10μM 的VdU中孵育 15 h，随后用1 - 2 mM PINK 孵育4 h。Live-cell荧光显微镜显示模式符合代谢标记，其中，具有亮粉色荧光的子细胞对仅在vdu处理的细胞中观察到，并且在PINK和非共价细胞核染料Hoechst 33342共定位（图3 a）。毒性研究使用MTT法来测量细胞存活率，发现低微摩尔浓度的PINK即使在较长的孵育时间也对细胞没有毒性。接下来，作者研究了PINK染色的细胞内反应动力学，发现5小时的时间是实现完全标记的理想时间，但仅孵育1小时后，就可以在背景上观察到清晰的信号(图3 b)。在多种细胞株中标记是有效的(图3 c)，从培养基中移除后，PINK的荧光信号在活细胞中保留了24小时。

图3  (A) 活HeLa细胞的DNA代谢标记和成像； (B) PINK的染色动力学；(C) U2OS细胞中VdU的活细胞代谢标记。

为了研究VdU-PINK标记对后续DNA合成的潜在影响，作者用5-乙基-2 -脱氧尿苷(EdU)进行了脉冲追踪实验(图4 a)。细胞用20 μM VdU孵育16 h，然后用PINK脉冲4 h。然后加入EdU 4小时，观察细胞固定和铜催化叠氮化物-炔环加成反应后的DNA合成过程。作者观察到PINK+和EdU+双阳性细胞共定位核染色。这些显著的结果表明，PINK-VdU反应产物没有引起细胞周期阻滞。因此，作者使用VdU和PINK来跟踪DNA合成和细胞分裂，使用活细胞，时间延迟成像。为了获得最佳的活细胞可视化效果，将细胞用100 μM VdU孵育23小时，然后用1 μM PINK标记4小时，以便记录2.5小时以上的完整有丝分裂周期(图4 b)。据作者所知，这些结果为活细胞中DNA复制的混合和测量荧光分析提供了第一个例子。

图4   （a）PINK脉冲追踪标记; （b）有丝分裂周期延时成像

综上所述，作者利用一种前所未有的双重增强策略开发了PINK，其中PINK的吖啶部分既作为荧光探针，又作为速率增强插层剂，同时四嗪作为荧光猝灭基团和生物正交官能基。据作者介绍，PINK是第一个荧光插层剂在活细胞中与核酸共价反应时显示荧光增强的例子。以往利用生物正交法对细胞内乙烯基修饰DNA进行化学修饰的研究都依赖于细胞固定和变性来促进四嗪-烯烃反应。天然DNA和RNA中反应生物正交功能基团的新能力将在生物学和转译研究中开辟新的机会，如动物染色体分离的实时研究，以及预测癌症患者的核苷药物反应。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/ange.202112931