中性粒细胞是人类血液中最为丰富的免疫细胞。在发生感染时，中性粒细胞是最先被招募到炎症部位的固有免疫细胞，通过吞噬、脱颗粒和以中性粒细胞胞外陷阱(NET)形式释放核物质的途径发挥抗微生物作用。

通过流式细胞术FSC vs SSC门控，可以区分大小或颗粒度不同的细胞，但无法鉴别物理特征相似的细胞。分化抗原(clusters of differentiation, CD) 通常用作免疫抗原辨识的细胞标记，可以用于鉴别细胞类型。但当不同细胞具有相同的CD标记时，须结合多种CD才可准确识别单一细胞种类。

该课题组通过对大量、多样化的荧光化合物库进行无偏筛选，开发了多个具有靶细胞特异性的荧光探针，可更为简便地鉴别区分细胞类型。

3.1 探针的发现

将红细胞裂解后所得到的白细胞用流式细胞术在荧光化合物库中进行无偏高通量筛选。先通过FSC vs SSC区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，然后选择其中强荧光的细胞作为靶细胞，再用抗体确认其类型。用上述方法，他们从几千个化合物中筛选出了具有粒细胞选择性趋势的BODIPY取代的脂肪酸(LFB)作为骨架，根据染色常数的计算结果从LFB中选出了NeutropG用于后续研究，并用CD16共染确认了该探针的中性粒细胞选择性。

图1 探针的发现过程

3.2 选择性验证

用免疫磁珠阴性分选法从粒细胞中分离出嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，得到了接近无损的中性粒细胞。用流式细胞术和荧光成像证实，NeutropG对中性粒细胞有出色的选择性。在亚细胞层面，通过与市售脂滴染料Nile Red共染验证，NeutropG定位于脂滴。

图2 NeutropG在粒细胞中的选择性和定位

3.3 NeutropG的选择性机制

脂肪酸通过被动运输或受转运蛋白CD36调节的方式进入细胞，在胞内长链酰基辅酶A合成酶(ACSL)的作用下转化为活化形式酰基辅酶A。在内质网中，酰基辅酶A在二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的催化下用于甘油三酯的生物合成。新合成的甘油三酯最后聚集在脂滴中。

将NeutropG与ER tracker RED或Nile Red共染，可以观察到荧光从内质网到脂滴的位置变化，与已知的脂滴生物合成过程一致，表明NeutropG可能和游离脂肪酸一样参与了脂滴的合成。

在脂滴合成中，ACSL1和DGAT2基因在中性粒细胞中比在其它细胞中显著更高表达，而CD36在中性粒细胞和嗜碱性粒细胞中表达水平相当且都远低于在外周血单个核细胞中的。用流式细胞术FSC vs SSC选出粒细胞，将其分为NeutropG-亮（即中性粒细胞）和 -暗（即嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的混合）两类。加入ACSL或DGAT的抑制剂显著抑制了中性粒细胞对NeutropG的摄取，但对另两类粒细胞无明显抑制，表明ACSL1和DGAT2的高表达是NeutropG对中性粒细胞选择性的关键。相较之下，高浓度的CD36抑制剂也不能显著抑制NeutropG染色，且在两类细胞中差别不明显，表明探针进入细胞不是脂滴生物合成总过程中的限速步骤，CD36与NeutropG的选择性相关程度低。在荧光成像结果中也观察到了同样的趋势。

将脂滴从相应细胞中提取出来，用TLC监测了在脂滴合成中摄入NeutropG的过程。在从加入探针的人血白细胞提取出的脂滴中，出现了NeutropG修饰的甘油三酯的新荧光点，而加入ACSL或DGAT的抑制剂则会使荧光明显减弱，表明NeutropG确实参与了脂滴的合成过程。

基于以上结果，他们将这种染色机制命名为代谢导向的活细胞鉴别法(Metabolism-Oriented Live-cell Distinction, MOLD)。

图3 NeutropG的靶标鉴别

3.4 粒细胞的三色成像

该课题组2012年报道过一个小分子荧光探针Histamine Blue，用于成像细胞内的组胺。他们用嗜碱性粒细胞标志物抗CD203c证实了，Histamine Blue可以在人血细胞中选择性成像嗜碱性粒细胞。Siglec-8是选择性高表达在成熟的嗜酸性粒细胞和肥大细胞上的抑制性受体，用红色抗体anti-Siglec-8可选择性成像嗜酸性粒细胞。将NeutropG、Histamine Blue和anti-Siglec-8共染，实现了粒细胞的三色成像，这种方法具有用荧光标记一次性区分粒细胞不同亚型的潜力。

图4 粒细胞的三色成像

3.5 人中性粒细胞迁移和吞噬作用的成像

用DAPI标记大肠杆菌，用NeutropG和细胞膜染料Cellmask Deep Red共染了中性粒细胞。将大肠杆菌加入中性粒细胞中，每隔10秒拍照，可以观察到中性粒细胞发现、近距离追逐、最终在180 s吞噬大肠杆菌的过程。值得注意的是，荧光标记没有严重影响中性粒细胞的功能，NeutropG适用于活功能细胞的实时成像。

图5 NeutropG成像的中粒细胞的迁移和吞噬作用

3.6 临床诊断

用NeutropG检测了来自医院的65个新鲜血液样本和40个不新鲜样本，将结果与临床检测方法所得结果作图。新鲜样本用两种方法检测得到的中性粒细胞含量非常相近，而不新鲜样本用测得的中性粒细胞数量远小于临床结果，表明中性粒细胞摄取NeutropG的过程依赖于活跃的代谢。他们认为，NeutropG有望应用于临床上精确定量血液样本中代谢活跃的中性粒细胞的水平。

图6 用临床方法和用NeutropG

进行中性粒细胞计数的结果比较

本文利用高通量筛选和生化合成，开发了首个用于鉴别和成像活中性粒细胞的小分子荧光探针NeutropG，通过酶抑制实验鉴定了其选择性机制。NeutropG可用于不同亚型粒细胞的三色成像，动态监测中性粒细胞通过吞噬作用清除大肠杆菌的过程，准确定量代谢活跃的中性粒细胞，有较高的临床潜力。

DOI：10.1002/anie.202108536