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PL酶APEX2和TurboID使用不同的标记化学物质,都使用生物素化底物,在蛋白质组富集过程中无法区分。所以作者设计了炔基酚(AP)底物作为生物素酚(BP)的替代物,作为APEX2的替代底物。从显微镜和western blot中发现并验证了APEX2/AP1对蛋白质组标记和富集的空间特异性。据此,作者利用APEX2和TurboID作为正交串联标记酶,实现对来源蛋白(由TurboID标记)到目的地的蛋白(由APEX2标记)的示踪。
为了实现对在293T细胞中由胞质到线粒体基质的蛋白质组示踪,作者分别在cytosol表达TurboID、在线粒体基质中表达APEX2,加入biotin启动TurboID标记,使用AP1和H2O2开始APEX标记,细胞裂解,进行western blotting分析。对这些样品进行双重富集,富集步骤后得到的蛋白质来自胞质并被运输到线粒体基质。正如预期,双重富集后,只有核编码的线粒体蛋白SDHA和GRSF1保留了下来,而12个mtDNA编码的蛋白没有被检测到。这证明了TransitID的高特异性及其根据线粒体蛋白起源区室区分线粒体蛋白的能力。
作者利用稳定表达mitto - apex2,瞬时表达TurboID- nes或TurboID-OMM的293T细胞,进行24小时追踪期的TransitID。通过液相色谱-串联质谱分析发现,实验中检测到4,210个蛋白,通过比较细胞质溶胶-线粒体样品与OMM-线粒体样品中的蛋白质富集分数,鉴定出148种蛋白质优先来自线粒体外膜而不是胞浆。随后用o -丙炔-嘌呤霉素(OPP)处理细胞以标记新合成的蛋白,用OMM-APEX2或APEX2-NES进行PL。MRPL30、MRPL48和HSP60在OPP/APEX2-OMM样品中的含量都高于OPP/APEX2-NES样品,这与TransitID蛋白质组学数据一致。
压力下,许多蛋白质重新定位以优先蛋白质质量控制和基因表达等重要过程,不能重新定位将导致细胞功能障碍或凋亡。为了分析应激下细胞质到细胞核蛋白质组运输的变化,作者准备了TurboID-NES和APEX2-NLS的HEK293T细胞,在亚砷酸钠诱导的氧化应激下进行2小时追逐实验,对已知的核细胞质穿梭标记物和细胞质驻留标记物印迹,确认试验方案的特异性。从细胞质转运到细胞核的1791个蛋白中,发现127个蛋白的转运在胁迫诱导下严重减少。对应激不敏感的DNA结合蛋白是细胞应激反应的关键调节因子,因此它们在应激下向细胞核的有效易位必须得到保护。
压力下,许多蛋白质重新定位以优先蛋白质质量控制和基因表达等重要过程,不能重新定位将导致细胞功能障碍或凋亡。为了分析应激下细胞质到细胞核蛋白质组运输的变化,作者准备了TurboID-NES和APEX2-NLS的HEK293T细胞,在亚砷酸钠诱导的氧化应激下进行2小时追逐实验,对已知的核细胞质穿梭标记物和细胞质驻留标记物印迹,确认试验方案的特异性。从细胞质转运到细胞核的1791个蛋白中,发现127个蛋白的转运在胁迫诱导下严重减少。对应激不敏感的DNA结合蛋白是细胞应激反应的关键调节因子,因此它们在应激下向细胞核的有效易位必须得到保护。
除此之外,作者还应用TransitID来研究巨噬细胞和癌细胞之间的蛋白质组通讯。首先将稳定表达TurboID-NES的MC38结肠癌细胞与稳定表达APEX2-NES的Raw264.7-ASC巨噬细胞共培养。获得69个目的蛋白,起源于MC38癌细胞细胞质,最终进入巨噬细胞细胞质。还发现了24种蛋白,它们以不受外泌体或纳米管抑制剂影响的方式从肿瘤细胞转运到巨噬细胞。并用M1巨噬细胞中炎症因子IL-1b和TNF-a的转移、M2巨噬细胞中抗炎因子TGF-b和IL-10的转移来验证TransitID的结果。
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