分享一篇发表在NAT CHEM上的文章，文章题目是“An electroaffinity labelling platform for chemoproteomic-based target identification”。本文的通讯作者是Rob C. Oslund、Olugbeminiyi O. Fadeyi和Phil S. Baran。Rob C. Oslund是InduPro的平台技术副总裁，领导公司的化学生物学和邻近标记技术。在加入InduPro之前，Rob是默克探索科学中心的创始成员，共同领导一个细胞化学团队，该团队专注于开发新的技术平台，他与人共同发明了基于光催化的邻近标记，此外，在默克公司期间，Rob开发了用于靶点识别的新型共价标记技术，并参与了多种模式不可知的药物发现计划。Olugbeminiyi O. Fadeyi任职于美国剑桥市默克公司探索科学中心，主要从事通过光催化邻近标记策略绘制肿瘤微环境中细胞与细胞的相互作用的研究。Phil S. Baran，任职于加利福尼亚州斯克里普斯研究所化学系，是一位年轻的有机合成大牛。2009年，Baran合成了史上最难合成的天然产物之一“Palau'amine”。Aiming for the Ideal Synthesis。提高药物发现过程中靶点选择的质量是降低临床中药物流失的重要因素之一；药效团是基于药效特征元素而建立的模型。可以分为两种类型：（1）一类是具有相同药理作用的类似物，它们具有某种相似的基本结构；（2）一类是一组化学结构完全不同的分子，但它们以相同的机理与同一受体键合，产生同样的药理作用；药物筛选及其靶点鉴定的一般流程是先通过细胞表型分析来筛选药物，利用该药物的一个药效团去设计一个三基团探针，药效团与靶蛋白相互作用，反应基团共价标记靶蛋白上的一些位点，然后通过可富集的标签进行富集，最后通过质谱鉴定靶蛋白是什么。传统的共价捕获技术依赖于使用基于化学或光化学的交联基团，化学交联剂总是处于激活状态，无法进行可控标记；光化学交联剂激活需要高能的紫外光，会产生多个活性部分，如具有不同生物活性的卡宾和二氮物质，这可能会使下游蛋白质组学分析和靶标鉴定复杂化。 在本文中，提出了一种在活细胞中进行亲电标记的技术（electroaffinity labelling—ECAL），该方法依赖于有机合成中很少探索的小官能团，二氮杂环丁酮（DZE），DZE通过一个电化学氧化还原，会形成一个新的活性中间体，该结构可与蛋白质上的氨基酸残基发生反应。可以把它附加到一个感兴趣的分子上进行配体定向共价标记，使复杂细胞环境中基于化学蛋白质组学的靶点识别成为可能。为了在药效团上放置一个反应基团，所需的反应基团应当满足下列要求：基于在氧化条件下产生的活性物质可能是亲电性的，适用于靶向活性氨基酸残基，通常是亲核性的多肽或蛋白质，所以设计反应基团还是从氧化激活这一方法出发。文献报道，含肼的物质可能是一个很有前途基团，因为它们在温和的条件下易于被氧化。DZE被鉴定为一个小的，容易获得的基序。重要的是，DZE的电化学氧化被发现提供了一种烯酮作为一种有效的亲电试剂，可以与蛋白质上亲核氨基酸发生共价反应。有了DZE的发现，作者首先评估了碳酸酐酶（CA）-DZE-去硫生物素三功能探针（sulfa-DZE）是否能以电化学依赖和选择性的方式标记游离的CA。去硫生物素试剂是生物素的有用替代物：与生物素相比，去硫生物素与链霉亲和素、抗生物素和其他生物素结合蛋白的亲和力较低，并且可以在更温和的条件下（即通过与常规游离生物素的竞争性置换）从结合复合物中洗脱。从WB结果可以看出，探针特异性的靶向CA，且标记的发生依赖于电化学氧化，可以被竞争剂可以被竞争掉。然后作者又将DZE与Diazirine做了一个比较，也是用CA来做的，电化学反应后酶解CA，肽段通过LC-MS来进行分析，来确定含有DZE加合产物的肽段的质量偏移。Diazirine（二氮嗪），与之前的μMap原理一样，diazirine在紫外光照射下被激活，生成活性卡宾，然后与氨基酸残基发生反应。 LC-MS（相当于纯蛋白的肽段）结果显示，Sulf-DZE的标记位点数要高于Diazirine，更广泛的氨基酸标记能增加从复杂环境中捕获共价结合蛋白的机会。 有了体外实验验证了方法的可行性，作者打算将该方法推广至活细胞内。图 11 活细胞中ECAL的流程图以及18和19号分子的胞内标记测试火山图的左右差别是体系里有无游离的JQ1/达沙替尼药物来竞争17和19号分子，从而来显示富集差异。使用JQ1-DZE-去硫生物素探针在HCT116细胞中进行靶向标记，鉴定到已知的结合伙伴BRD4和BRD2显著富集；使用达沙替尼-DZE-去硫生物素探针在HCT116细胞中进行靶向标记，SRC激酶（一种已知的达沙替尼配体）被确定为一个高度富集的靶点。 对JQ1-DZE-去硫生物素和达沙替尼-DZE-去硫生物素中检测到的25种最富集的蛋白质进行比较，发现靶向标记没有直接的蛋白质重叠，而GO分析存在明显差异，说明探针的特异性很好。4.ECAL用于REV-ERB配体的化学蛋白质组学分析REV-ERB：又称NR1D1，是生物中核受体家族成员，可作为抑制调节因子参与众多的生命过程，包括肿瘤、代谢、增殖和炎症等，因此它是一个潜在的药物靶点。（1）SR9009和SR9011化合物最初是在斯克里普斯开发的作为转录因子REV-ERBα和REV-ERBβ的合成激动剂，用于调节昼夜节律。（2）SR9009的细胞治疗与REV-ERBα介导的通过增加骨骼肌产生线粒体来增强运动能力有关。市面上还出现了非法使用这些基于SR9009的激动剂作为运动补充剂和性能增强剂。（3）SR9009和SR9011也显示出了影响其他生物过程的能力，包括Th17细胞介导的自身免疫的负调控和肿瘤细胞杀伤，所有这些都可能是通过REV-ERB调节来实现的。然而，尽管SR9009和SR9011在体内和体外有多种活性，但缺乏对REV-ERB作为蛋白靶点的直接鉴定。因此，作者开始使用ECAL技术来对此进行一个验证。为了确认合成的TA-DZE探针是否保留了所需的药理特性，我们在之前报道的原代细胞分化实验中与亲本化合物SR9009和SR9011进行了筛选。人原代CD4 T细胞在Th17分化条件下培养，含或不含化合物（DMSO、SR9009、SR9011和TA-DZE探针）。与母本化合物SR9009和SR9011相似，TA-DZE探针处理抑制了Th17的分化。IL-17A主要由Th17细胞产生。结果说明TA-DZE保留了药理活性。使用TA-DZE探针，使用ECAL对过表达REV-ERB的HEK293T细胞进行化学蛋白质组学分析。将HEK293T-REV-ERBα细胞与TA-DZE探针孵育，同时电解或不电解。在电化学处理步骤后，标记蛋白通过Click反应与生物素叠氮化物结合，并通过链霉亲和素珠子富集。富集的蛋白进行胰蛋白酶消化和下游基于TMT的定量LC-MS/MS分析。火山图分析显示，过表达TA-DZE-ERBα的HEK293T细胞处理，无论有无电化学激活，均不能富集REV-ERBα。表明这些TA结构可能独立于REV-ERB发挥作用，并没有直接的相互作用关系。本文报道了一种基于电化学的活细胞靶向蛋白标记平台。该技术依赖于使用一个极简的DZE官能团，利用其固有的电化学活化特性来生成一个用于共价蛋白标记的活性中间体。通过将DZE附加到感兴趣的小分子配体上，可以在游离蛋白质和复杂的细胞环境中以电化学依赖的方式实现蛋白质的靶向标记。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-023-01240-y原文引用：https://doi.org/10.1038/s41557-023-01240-y
目前评论：