分享一篇发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry上的文章，Sample pH Can Drift during Native Mass Spectrometry Experiments: Results from Ratiometric Fluorescence Imaging[1]，文章的通讯作者是来自华盛顿大学的Matthew F. Bush副教授。电喷雾电离（ESI）的出现使得通过质谱对生物大分子进行分析成为可能。Native MS用于研究生物分子的结构和相互作用，通过利用nano ESI和中性的挥发性电解质（如乙酸铵），可以使蛋白质离子从溶液相转移至气相时仍保有原本的蛋白质结构记忆。但是，在电喷雾电离过程中会发生一系列的电化学反应，使样品的pH值发生变化。而生物分子的结构、相互作用和活性强烈依赖于pH值，因此定量了解Native MS中电喷雾对样品pH值的影响是意义重大的。这篇文章为了实现这一目标，使用了pH依赖型荧光探针分子，并在离子生成过程中对样品进行比率荧光成像分析，从而分析关联测量值和溶液pH值，并将样品pH值表征为电喷雾电流、电解质浓度和电喷雾极性的函数。 
图1 SNARF-4F的荧光光谱
作者首先通过比率荧光成像技术考察了在电离过程中nanESI毛细管内溶液的pH值变化，探针分子使用的是具有pH依赖发射光谱的SNARF-4F（如图1所示），用于探测ESI液滴蒸发过程中发生的pH值变化。调节至图1所示pH值的200mM乙酸铵水溶液，使用530nm的激发波长，用发光分光光度计收集发射光谱。在最低pH值3.4下，SNARF-4F的激发导致发射光谱在585nm附近具有最大相对强度，而在更长的波长处强度较低。585nm处的特征强度随着溶液pH值的增加而降低，在pH值为7.4时几乎消失，而较长波长的相对强度增加，并出现在652nm附近。根据这些光谱信息选择中心在577nm和655nm附近的带通滤波器，阴影区域跨越这些滤波器的近似透射窗口。
图3 图A-D展示了荧光比率单次测量的代表性数据。（A）使用577nm带通滤波器获得的荧光图像。（B）使用655nm带通滤波器获得的荧光图像。相邻像素的强度被分箱后使用阈值进行掩蔽。（C）对于每个分箱的像素，使用655nm带通滤光器的强度与使用577nm带通滤光器的强度计算出比率。（D）对于每个分箱的像素，使用655nm带通滤光器的强度绘制为使用577nm带通滤光器强度的函数；该数据的斜率用于确定该对图像的荧光比率。（E）通过测量SNARF-4F标准的荧光比率生成的校准曲线。
图4 在10mM乙酸铵中制备的伴刀豆蛋白A样品的Native MS分析。在pH7.0下制备的样品代表性质谱，其在（A）最初和（B）电离30min后获得。该m/z范围内的峰被确定为二聚体和四聚体；也有较低强度、较低m/z的峰归属于单体。(C)在pH 6.0下制备的样品的代表性质谱。四聚体分数TF定义为四聚体离子(m/z在4250和5400之间)的强度总和除以二聚体离子(m/z在3000和3900之间)和四聚体离子的强度总和；所有强度通过寡聚状态加权。(D)对于在pH 7.0下制备的样品的6次技术重复，四聚体分数作为电离时间的函数；对于所有重复，四聚体比例随着电离时间的增加而降低。展示了在pH 6.0时制备的4个样品的结果用于比较。所有实验都使用60 nA的电喷雾电流。
伴刀豆蛋白A是一种碳水化合物结合蛋白，在接近中性pH的溶液中主要形成二聚体和四聚体，而四聚体的相对强度会随着pH增加而增加。从图4A和图4B可以发现，在pH为7.0的条件下，随着采集时间的增加，四聚体形式的相对强度下降。而当pH降低至6.0时，其四聚体形式的相对强度（图4C）和pH7.0采集时间30min的（图4B）相似，综合两种实验现象，作者推测电喷雾溶液随着采集时间的增加会发生酸化。
图5 使用60 nA的电喷雾电流，测量200 mM乙酸铵水溶液的荧光强度比率分析作为时间的函数。所有溶液最初的pH值均为7.0。(A)在52分钟内，125组捕获SNARF-4F在655nm和577 nm荧光的图像被记录下来。(B)相应表观pH值根据图3E中的数据计算。展示了11次技术重复的平均值和95%置信区间。阴影块代表时间区域I-IV。
图5展示了多次技术重复后的结果，在电喷雾的第一个10分钟内(区域I)，溶液的荧光比率缓慢下降，平均为0.02min-1。在区域II，10-20分钟内，荧光比率的变化率增加到0.06min-1。区域III类似，表现出0.05min-1的平均变化。区域IV显示明显减慢至0.02min-1，并且在实验结束时观察到比值明显变平。所有现状实验都导致表观pH值下降超过1个pH单位；平均而言，34分钟后，表观pH值降至6以下。
图6 不同电喷雾电流下溶液pH值的变化曲线
随着电喷雾电流的增大，溶液pH值变化越来越快。120 nA(绿色区域)的电流几乎立即导致了溶液pH值的降低，而30 nA(蓝色区域)的电流在酸化开始前存在一段稳定期。每条虚线代表一组技术重复(每个重复n = 4)。透明米色区域为使用60 nA电喷雾电流进行11次技术重复并跨越95%置信区间的结果。
图7 基于在正离子模式下使用60 nA电流的实验探究乙酸铵浓度对样品pH值随时间变化的影响
1 M醋酸铵水溶液(蓝色区域)受到pH值变化的影响最小。10 mM醋酸铵水溶液(绿色区域)显示出在增加电势后不久即开始快速酸化。每条虚线代表一组技术重复(每个重复n = 4)。透明米色区域为使用200mM醋酸铵、60 nA电喷雾电流进行11次技术重复并跨越95%置信区间的结果。这一结果表明，在nano ESI的实际应用中，相对于较低的电解质浓度而言，较高的电解质浓度在抵抗电喷雾引起的pH变化方面更有效。高浓度的乙酸铵还可以通过降低金属离子加合物的相对丰度来改善蛋白质质谱的质量。然而，电解质的浓度也会影响蛋白质中的静电相互作用，从而影响蛋白质配体和蛋白质在溶液中相互作用的强度。因此这提示我们，在选择与分析物和生物环境相关的电解质浓度时，应小心谨慎。
图8 施加负电位对样品pH值的影响作为时间的函数
在负电位下，使用200 mM乙酸铵和60 nA电流(紫色区域，n = 6次技术重复)在整个实验中显示荧光比率的小幅增加，而10 mM乙酸铵和60 nA的电流(绿色区域，n = 2次技术重复)显示溶液的轻微碱化。与相同条件下的正电位数据相比，负电位对电喷雾的影响较小。综合所有的实验结果，作者认为在许多Native MS实验中，样品pH值会发生漂移，而许多蛋白质的性质受pH值的影响较大，因此在设计和分析Native MS实验时可以考虑以下因素：（1）适宜的参数，如高电解质浓度、负极性电离和低电离电流，这些参数可以减轻实验过程中pH值的变化；（2）使用正负极性采集数据；（3）比较在同一nano ESI实验期间不同时间间隔采集的数据。
撰稿：梁梓欣
编辑：李惠琳
文章引用：Sample pH Can Drift during Native Mass Spectrometry Experiments: Results from Ratiometric Fluorescence Imaging
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